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1目的建立稳定的成年和幼年SD大鼠肺重度冲击伤动物模型,通过观察和比较成年与幼年大鼠的SP-A、SP-B在冲击伤后不同时间点的转录和表达的改变,揭示肺组织发育成熟差异与肺冲击伤损伤的关系与特点,探讨SP-A和SP-B在肺冲击伤后病理生理中的作用地位和机制,为肺冲击伤损伤的临床救治提供新的理论基础和指导依据。2主要研究内容和方法2.1成年和幼年大鼠肺重度冲击伤模型的建立分别选取20天龄的幼年健康SD雄性大鼠和(250±15)g成年健康SD雄性大鼠各40只,用BST-Ⅰ型生物激波管,采用不同的驱动压致冲击伤。依据采用激波管驱动压的不同,成年大鼠随机分为4组:4.5Mpa、4.8Mpa、5.0Mpa和5.5Mpa组,每组各10只;幼年大鼠随机分为4.8Mpa、5.0Mpa、5.5Mpa和5.8Mpa组,每组各10只。致伤后观察记录各组大鼠的一般生理状况和24h存活情况;于伤后24h麻醉后活杀存活的动物,重点对肺脏行大体解剖观察、肺损伤严重程度评分(肺脏损伤程度分级(OIS)和简明损伤评分(AIS)),取肺组织病理标本行光镜病理观察。最终筛选出肺损伤伤情相似的成年和幼年大鼠肺重度冲击伤模型以备下一步实验应用。2.2成年和幼年大鼠肺重度冲击伤后SP-A和SP-B的研究:分别选取成年和20天龄的幼年健康的雄性SD大鼠各48只,分别各自随机分为6组,分别为正常对照组、冲击伤后0h、2h、4h、6h、12h、24h、48h和72h组(每组8只)。成年大鼠的致伤驱动压力值为5.0Mpa,幼年大鼠的冲击伤致伤驱动压力值为5.5Mpa。致伤后观察各组动物的一般情况,各组动物分别于其相应时间点麻醉后放血活杀,行大体解剖观察,各取左下叶肺组织两小块分别做肺组织光镜病理观察和组织匀浆;对余下的肺组织进行肺泡灌洗,收集肺泡灌洗液。主要观察指标内容如下:(1)动物一般情况、肺损伤大体和光镜病理观察,以及肺损伤严重程度评估(OIS和AIS评分)等;(2)采用Real Time PCR方法检测肺组织内SP-A和SP-B m RNA的转录水平变化;(3)采用Western Bolt方法检测肺组织中SP-A和SP-B的表达变化及半定量分析。(4)采用ELISA方法检测肺泡灌洗液中SP-A和SP-B的蛋白浓度水平变化。3主要结果3.1成年和幼年大鼠肺脏重度冲击伤模型的建立各组的成年和幼年大鼠冲击伤后均发生明显肺冲击伤,表现为不同程度的肺出血、水肿、不张、肺组织破裂等,驱动压力值越高,伤情越重。在同样的冲击波致伤压力条件下,成年大鼠的肺损伤明显较幼年大鼠的严重。成年大鼠在驱动压力值为5.0Mpa时,肺脏的损伤程度集中在Ⅳ级(60%),AIS评分为3.00±0.47,达到重度伤情;幼年大鼠在驱动压力值为5.5Mpa时,肺脏损伤多集中在Ⅳ级(70%),AIS评分为3.10±0.56。两者肺脏损伤程度大致相同,且无显著统计学差异(p>0.05),均为肺脏损伤的重度伤情,符合下一步研究模型的需求。3.2成年和幼年大鼠肺重度冲击伤后SP-A和SP-B的研究(1)伤情的特点和变化:幼年和成年大鼠均发生重度肺冲击伤,两组间伤情没有明显统计学差异;但幼年大鼠的肺损伤程度最重的峰值出现在伤后4h,而成年大鼠的则后续到伤后6h。(2)肺组织的SP-A和SP-B的m RNA RT-PCR检测结果:幼年大鼠SP-A的m RNA相对量在伤后即刻迅速显著下降(P<0.05),伤后4h又迅速上升达到峰值,为正常的398%(P<0.05),随后又逐渐回落,24h后又低于正常;而SP-B的m RNA在伤后迅速逐渐升高(P<0.05),6h达峰值,为正常10.6倍(p<0.01),伤后12h回落到正常范围,24h~72h又缓慢升高(P<0.05)。成年大鼠SP-A的m RNA在伤后即刻先显著上升(P<0.05),随后降低,伤后4h达到最低,为正常组的76%,随后逐渐回升,在伤后48h和72h达正常组的418%和415%(p<0.01);而成年SP-B的m RNA量于致伤后逐渐下降,在伤后12h达到谷底,为正常组的25%(p<0.01),随后缓慢有所回升,伤后72h时为正常组的86%(P>0.05)。(3)肺组织中SP-A和SP-B的Western Bolt检测结果:冲击伤后幼年大鼠肺组织中SP-A蛋白含量首先迅速下降,伤后4h达到谷底,为正常74.7%(P<0.05);随后逐渐回升,并在伤后24h~72h显著高于正常,72h时达正常的188.9%(p<0.05)。而幼年大鼠肺组织中SP-B蛋白含量则出现先升高后回落的趋势,在伤后4h达到峰值,为正常的137.2%(P<0.05);随后逐渐回落,伤后24h~72h与正常组无显著差异(p>0.05)。成年大鼠肺组织中SP-A、SP-B含量的变化趋势和幼年大鼠相似。(4)肺泡灌洗液中SP-A和SP-B ELISA检测结果:幼年大鼠肺泡灌洗液中SP-A的量在伤后迅速减少,伤后4h达到最低,为正常的43.4%(P<0.05);随后逐渐回升,伤后24h回到正常水平,48h和72h时高于正常值(P<0.05),分别为正常组的123.7%和132.8%。幼年大鼠肺泡灌洗液中SP-B的达量则是在伤后先逐渐升高,伤后4h达到峰值,显著高于正常(P<0.05),为正常的170.6%;随后逐渐回落,伤后24h后接近正常水平(P>0.05)。在成年大鼠冲击伤后,肺泡灌洗液中SP-A或SP-B含量的变化趋势与幼年组相似(p>0.05),但成年大鼠组别的SP-A和SP-B的含量值水平比幼年组各时间点的表达量高,具有统计学意义(p<0.05)。4结论(1)成年和幼年大鼠的肺冲击伤均表现为不同程度的肺出血、水肿、不张、肺组织破裂等,致伤的压力值越高,伤情越重。在同样的冲击波致伤压力条件下,成年大鼠的肺损伤明显重于幼年大鼠。(2)通过BST-Ⅰ型生物激波管,采用5.0Mpa驱动压可以建立成年大鼠肺重度冲击伤模型,以及采用5.5Mpa驱动压建立的幼年大鼠肺重度冲击伤模型,这两个模型的伤情具一致性且稳定,且具有可比性和可重复性,适用于研究未成年肺和成年肺冲击伤的发生发展和救治机制的对比研究。(3)在本实验相同的肺重度损伤模型下,成年和幼年各自的SP-A和SP-B的m RNA转录变化趋势明显不同:(1)幼年大鼠SP-A的m RNA相对量,伤后即刻先迅速显著下降,随后伤后4h又迅速上升达到峰值(正常的398%,P<0.05),然后又逐渐回落,24h后又低于正常;成年大鼠SP-A的m RNA则在伤后即刻先显著上升(P<0.05),随后降低,伤后4h达到最低(正常组的76%,P<0.05),随后逐渐回升,在伤后48h到72h达正常组的418%和415%(p<0.01)。(2)幼年大鼠SP-B的m RNA在伤后是迅速逐渐升高(P<0.05),6h达峰值(正常的10.6倍,p<0.01),伤后12h回落到正常范围,24h到72h又缓慢升高(P<0.05);而成年SP-B的m RNA量于致伤后逐渐下降,在伤后12h达到谷底(正常的25%,p<0.01),随后缓慢有所回升,伤后72h时为正常组的86%(P>0.05)。(4)而在成年和幼年大鼠,无论是在肺泡灌洗液或是肺脏实质中,其SP-A和SP-B的蛋白含量的变化趋势是相似的。其SP-A的表达量是先降后回升的趋势,于伤后4h达最低值。而SP-B的表达量从伤后2h逐步增多,伤后4h达到最高值,随后缓慢下降直到伤后12h,随后不再受时间的影响,其表达量基本维持在正常对照组的分泌水平。(5)在同样的重度肺冲击伤的条件下,幼年大鼠肺损伤的峰时略早于成年大鼠;幼年和成年大鼠冲击伤后肺组织和肺泡灌洗液中SP-A和SP-B蛋白量的变化趋势相似,均为SP-A先减少再回升、SP-B先增加后回调,因此会出现明显的SP-A和SP-B比例的失衡;同时是其m RNA转录的变化差异极大(幼年大鼠后期的SP降低等更显著,p<0.05),其机制与意义非常值得深入的研究和分析。