一、脂质体姜黄素的制备目的:本实验致力于制备脂质体姜黄素并初步检测其理化特性。方法:(1)利用脂质体包封技术制备脂质体姜黄素。(2)HPLC检测脂质体姜黄素浓度及纯度。(3)粒度电位仪测量脂质体姜黄素粒度分布及Zeta电位。(4)观察脂质体姜黄素外观及分散情况。结果:(1)HPLC检测显示,脂质体姜黄素在11.831分出峰,姜黄素标准品在11.835分出峰,脂质体及辅料未出峰。(2)脂质体姜黄素的浓度为1mg/ml,纯度较好。(3)脂质体姜黄素平均粒径为126.8nm,Zeta电位为-8.88mV。(4)所得脂质体姜黄素外观呈均一半透明的淡黄色乳液;可完全均匀散布于纯水,无固体物和沉淀形成。结论:(1)成功制备脂质体姜黄素。(2)制备的脂质体姜黄素稳定、纯度较好,为后续实验研究奠定了基础。二、脂质体姜黄素治疗子宫内膜癌基础与临床前研究目的:本实验致力于初步探讨脂质体姜黄素用于治疗子宫内膜癌的可能性,并分析其可能的作用机制。方法:(1)选择不同浓度的脂质体姜黄素处理人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1,24小时后,利用MTT法测定抑制率;并作回归分析,计算细胞增殖抑制率达 15-20%、50%时剂量(IC15-20、IC50)。(2)采用Hoechst 33258荧光染色法和AnnexinV/PI双染流式细胞术检测经IC15-20、IC50脂质体姜黄素处理的人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1凋亡情况。(3)以划痕试验、transwell试验检测经低于IC15-20浓度脂质体姜黄素处理的人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1侵袭、转移情况。(4)荧光定量PCR(RT-qPCR)检测经0-IC50浓度脂质体姜黄素处理后人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1其NF-κB mRNA水平的表达。(5)Western Blot检测经不同浓度脂质体姜黄素处理后人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1 NF-κB蛋白及其下游Caspase-3、MMP-9蛋白的表达水平。(6)以斑马鱼模式动物为平台,检测脂质体姜黄素的毒理学效应。(7)以IC15-20、IC50脂质体姜黄素处理子宫内膜癌斑马鱼动物模型,荧光检测评价体内抑瘤效应,并以RT-qPCR检测处理后NF-κB mRNA水平的表达。结果:(1)MTT法检测显示,脂质体姜黄素对人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1的具有显著的增殖抑制效应,并呈一定程度的浓度依懒性;回归分析显示其 IC15-20 分别为 15、30μM,IC50 分别为 50、80μM。(2)荧光染色法显示,人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1经IC15-20的脂质体姜黄素处理后可发生典型的凋亡形态学改变;流式细胞术检测进一步显示,Ishikawa和HEC-1经IC15-20、IC50的脂质体姜黄素处理后凋亡率分别为15.12±0.59%、43.25%±1.48%和 9.67%±0.79%、38.79%±4.55%,较对照显著增高。(3)划痕试验提示,经低于IC15-20浓度脂质体姜黄素处理的人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1迁移能力较对照组明显减弱;transwell试验进一步证实经低于 IC15-20 浓度(Ishikawa:5,10μM;HEC-1:10,20μM)脂质体姜黄素处理的人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1侵袭能力显著低于对照组,分别为 34.88%、81.93%和 41.3%、89.57%。(4)RT-qPCR检测显示,经0-IC50浓度脂质体姜黄素处理的人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1其NF-κB mRNA水平较对照组显著降低,并呈一定程度的浓度依懒性。(5)Western Blot检测显示,经不同浓度脂质体姜黄素处理的人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1其NF-κB蛋白核表达水平、Caspase-3总蛋白及MMP-9蛋白表达水平均较对照组显著降低,而被剪切激活的Caspase-3蛋白表达水平则较对照组显著升高。(6)毒理学检测显示,0-80μM范围内脂质体姜黄素处理6h未对斑马鱼产生明显的急性毒理学作用。(7)子宫内膜癌斑马鱼动物模型结果显示,脂质体姜黄素处理组较之对照组可产生显著的抑瘤作用;且其NF-κB mRNA水平较对照组显著降低。结论:(1)脂质体姜黄素通过抑制NF-κB信号通路,继而影响Caspase-3及MMP-9活性,在体外不仅可诱导子宫内膜癌肿瘤细胞的凋亡,还可以显著抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,在体内依然可显著抑制子宫内膜癌移植瘤生长;且无毒无害。(2)脂质体姜黄素有治疗子宫内膜癌的潜在应用价值。三、脂质体姜黄素联合放疗治疗子宫内膜癌基础与临床前研究目的:本实验致力于初步探讨脂质体姜黄素与放疗联合治疗子宫内膜癌的可能性,并分析其可能的作用机制。方法:(1)收集2015年1月-2017年12月江苏省肿瘤医院放疗科收治的5例子宫内膜癌患者放疗前后的癌组织标本,以免疫组化方法分析其癌组织中NF-κB核表达水平的变化。(2)用不同剂量照射处理人子宫内膜癌Ishikawa细胞;以RT-qPCR法检测照射前后NF-κB mRNA水平的变化,以ELISA法检测照射前后NF-κB转录活性的变化。(3)采用克隆成形试验,检测人子宫内膜癌Ishikawa细胞经脂质体姜黄素±照射处理后细胞的克隆成形率。(4)采用Annexin V/PI双染流式细胞术,检测人子宫内膜癌Ishikawa细胞经脂质体姜黄素±照射处理后细胞的凋亡情况。(5)采用RT-qPCR及Western Blot方法,检测人子宫内膜癌Ishikawa细胞经脂质体姜黄素±照射处理后细胞NF-κB mRNA、蛋白水平的变化。(6)采用荧光检测法,评价荷人子宫内膜癌细胞斑马鱼动物模型经脂质体姜黄素±照射处理后的抑瘤效应;以RT-qPCR方法检测其NF-κB mRNA水平的变化,以ELISA法检测其NF-κB转录活性的变化。结果:(1)免疫组化检测显示,放疗后子宫内膜癌组织NF-κB蛋白核表达水平显著上升,尤其是P65蛋白。(2)RT-qPCR检测显示,经照射处理(3-12Gy)后人子宫内膜癌Ishikawa细胞NF-κB mRNA水平较对照组显著升高,并呈一定程度的照射剂量依懒性。ELISA法检测结果同样显示,经照射处理(3-12Gy)后人子宫内膜癌Ishikawa细胞NF-κB转录活性较对照组显著升高,并呈一定程度的照射剂量依懒性。(3)克隆成形试验检测显示,经15μM或50μM脂质体姜黄素联合2Gy或4Gy照射处理后,人子宫内膜癌Ishikawa细胞的克隆成形率较对照组、单纯照射组及单纯脂质体姜黄素处理组显著降低。(4)Annexin V/PI双染流式细胞术检测显示,经15μM脂质体姜黄素联合2Gy照射处理后,人子宫内膜癌Ishikawa细胞的凋亡率较对照组、脂质体姜黄素处理组及单纯照射组显著升高。(5)RT-qPCR检测显示,经15μM脂质体姜黄素联合2Gy照射处理后,人子宫内膜癌Ishikawa细胞NF-κB mRNA水平较对照组、单纯照射组及单纯脂质体姜黄素处理组显著降低;Western Blot检测显示,经15μM脂质体姜黄素联合2Gy照射处理后,人子宫内膜癌Ishikawa细胞NF-κB核蛋白表达水平较对照组、单纯照射组显著降低,与单纯脂质体姜黄素处理组差异无显著性。(6)子宫内膜癌斑马鱼动物模型结果显示,经15μM脂质体姜黄素联合2Gy照射处理后,移植瘤的生长较对照组、单纯照射组及单纯脂质体姜黄素处理组显著受抑;RT-qPCR检测亦显示,其NF-κB mRNA水平较对照组、单纯照射组显著降低,与单纯脂质体姜黄素处理组差异无显著性;ELISA法检测结果同样显示,其NF-κB转录活性较对照组、单纯照射组显著降低,与单纯脂质体姜黄素处理组差异无显著性。结论:(1)放疗可以激活子宫内膜癌细胞的NF-κB信号通路。(2)通过抑制NF-κB信号通路,脂质体姜黄素联合放疗在体外不仅可显著抑制子宫内膜癌肿瘤细胞株的增殖与迁移,而且可以明显诱导凋亡,在体内亦可显著抑制子宫内膜癌移植瘤的生长。(3)脂质体姜黄素具有放疗增敏作用,与放疗联合有治疗子宫内膜癌的潜在应用价值。