研究背景:我国是世界上高原面积最大、海拔最高、居住人口最多的国家,海拔3000 m以上的高原、高山地区占我国国土总面积的1/4,主要分布在西藏、青海和新疆一带。这些地区是国家实施西部大开发战略的重要战场,随着青藏铁路的开通、高原地区国民经济的发展和旅游事业的兴旺,进入高原的人群成倍增长。高原地区的大气压、氧分压、温度、湿度等都不同于平原地区,这些因素的改变对机体造成的影响是广泛的,包括对心血管系统、神经系统、消化系统等多方面的影响。在这些影响因素中低氧是最主要的影响因素,以往的研究多集中于高原低氧对急进高原人群及久居高原人群身体机能的影响,而对于反复进入高原后又返回平原,从事高原运输、高原旅游等人群的实验研究较少。间歇性低氧(intermittent hypoxia,IH)是指机体或组织间断处于低氧环境。研究表明,间歇性低氧对机体组织的影响取决于低氧的程度、低氧的持续时间、以及低氧-常氧交替方式。胆碱,作为B族维生素中的一种重要的水溶性营养物质,在许多生理过程中如信号转导、生物合成及保持细胞膜的完整性中起重要作用。研究表明,低氧暴露可以改变胆碱代谢。但胆碱对低氧损伤的影响尚不清楚。研究目的:本文拟从整体水平和细胞水平研究间歇低氧对氧化应激和内皮功能的影响,并探讨其作用机制,为高原疾病防治研究提供理论依据;观察胆碱在血管内皮细胞低氧损伤中的作用,为进一步探究其作为抗低氧损伤的药物提供参考。研究方法:1.间歇低氧对大鼠氧化应激和内皮功能的影响选取48只雄性Wistar大鼠,体重180~200g,随机分为常氧组和低氧组,每组各24只。常氧组在正常情况下饲养,低氧组大鼠于低压氧舱中接受模拟6000米海拔高度、15℃的低压低氧处理,每天8小时,其余时间在正常情况下饲养。实验进行7d、14d、21d、28d后,常氧组和低氧组分别各取6只大鼠,取材后测定大鼠血清、心肌组织、脑组织、肝组织、肾组织中MDA含量、SOD和T-AOC水平研究其氧化应激变化,以及检测血清NO和ET含量、VEGF的表达观察内皮功能的变化。2.间歇低氧对血管内皮细胞氧化应激和内皮功能的影响采用主动脉血管片贴壁培养法,体外培养雄性Wistar大鼠主动脉血管内皮细胞,分别设置对照组,间歇低氧组:对照组:21%O2,37℃,48h;间歇低氧27h组:低氧(1%O2,37℃)27h,再复氧(21%O2,37℃)21h;间歇低氧30h组:低氧(1%O2,37℃)30h,再复氧(21%O2,37℃)18h。分别在低氧和复氧结束后收集对照组和间歇低氧组细胞上清,检测MDA、SOD、NO、ET水平变化。另设置正常对照组、不同浓度H202组、低氧组及低氧复合H202组研究氧化应激对血管内皮细胞的损伤作用。3.胆碱抗低氧损伤的内皮细胞保护作用体外培养雄性Wistar大鼠主动脉血管内皮细胞,分别设置对照组(21%O2,37℃)、低氧组(1%O2,37℃)、胆碱组、胆碱+拮抗剂组,检测细胞存活率、细胞培养液中LDH的释放及VEGF的表达。研究结果:1.慢性间歇性低氧对大鼠氧化应激和内皮功能的影响(1)慢性间歇性低氧对大鼠氧化应激的影响血清:间歇低氧1、2、3周后,与对照组相比,低氧组大鼠血清MDA无显著性变化;而间歇低氧4周后,与对照组相比,低氧组大鼠血清MDA水平显著升高(P<0.05);间歇低氧前3周,对照组与低氧组大鼠血清SOD水平无显著性差异。间歇低氧4周后,与对照组相比,低氧组大鼠血清SOD水平显著降低(P<0.01);T-AOC水平在不同时间间歇低氧干预后均升高,并于第2、3、4周出现显著性差异(P<0.01)。心肌组织:与对照组相比,心肌组织MDA含量在大鼠间歇低氧1、2、3、4周后均出现显著性升高(P<0.01);SOD水平在不同低氧时间干预后均降低,且在第2、4周后出现显著性降低(P<0.05);T-AOC水平也在各周后出现降低趋势。脑组织:与对照组相比,脑组织MDA含量在大鼠间歇低氧1、2、3、4周后均有降低趋势,且第4周后出现显著性差异(P<0.05);SOD在不同低氧时间干预后均降低,且在第2周后出现显著性降低(P<0.05);T-AOC在各周后出现不同程度的升高,但无统计学意义。肝组织:与对照组相比,肝组织MDA含量在大鼠间歇低氧1、3、4周后均降低,且第4周后出现显著性差异(P<0.05);SOD在不同低氧时间干预后均出现降低趋势,但无显著性差异;T-AOC在各周后出现不同程度的降低,且在第3、4周后出现极显著性差异(P<0.01)。肾组织:与对照组相比,肝组织MDA含量在大鼠间歇低氧各周后均有升高趋势,且在第4周后出现显著性差异(P<0.05);SOD在间歇低氧干预各周后出现降低趋势;T-AOC在各周后出现升高趋势,但各组间无显著性差异。(2)慢性间歇性低氧对大鼠内皮功能的影响与对照组相比,大鼠血清NO含量在第2周后开始降低,且第2周和第4周有显著性差异(P<0.05);血清ET在不同时间间歇低氧干预后均有降低趋势,且在第2周后出现显著性差异(P<0.05);血清VEGF的表达在第1、2、4周后均有降低趋势,但并无统计学意义。2.间歇性低氧对血管内皮细胞氧化应激和内皮功能的影响(1)间歇性低氧对血管内皮细胞氧化应激的影响间歇低氧27h组,与对照组相比,低氧和复氧后血管内皮细胞MDA水平均无显著性差异;间歇低氧30h组,与对照组相比,复氧18h后间歇低氧组血管内皮细胞MDA水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。因此,我们选择低氧30h、复氧18h研究间歇低氧对血管内皮细胞的影响。间歇低氧30h组细胞在复氧结束后SOD水平有降低趋势,但并不具有统计学意义。不同浓度H2O2干预6h、12h、24h、27h后,各组细胞存活率并无显著性差异。而干预30h后,与对照组相比,800μmol/L H2O2浓度组细胞存活率显著下降(P<0.01),LDH的释放显著升高(P<0.01)。与对照组相比,低氧组、H2O2组和低氧复合H2O2组细胞存活率显著下降(P<0.05),H2O2组、复合组LDH的释放显著升高(P<0.01)。(2)间歇性低氧对血管内皮细胞内皮功能的影响与对照组相比,低氧结束后,间歇低氧组血管内皮细胞NO水平显著降低,ET水平显著升高(P<0.05);而经过18h的复氧,低氧组NO的释放显著升高,同时ET的释放显著降低(P<0.01).3.胆碱抗低氧损伤的内皮细胞保护作用常氧条件下,胆碱处理大鼠主动脉内皮细胞24-48h,细胞存活率升高,而LDH没有显著差异(P>0.05);低氧条件下,胆碱处理内皮细胞24-48h,0.1-10μmol/L使大鼠主动脉内皮细胞细胞存活率升高,而降低LDH水平(P<0.05)。低氧24h后内皮细胞分泌的VEGF显著升高(P<0.05),10μmol/L胆碱能够进一步增加内皮细胞分泌VEGF(P<0.01);低氧条件下,与胆碱孵育组相比,拮抗剂MLA组的细胞存活率显著下降(P<0.01)。结论:1.慢性间歇性低氧暴露(模拟海拔6000m,8h/d)不同时间后可以使大鼠氧化应激系统激活,血清、心肌组织、脑组织、肝组织、肾组织氧化应激程度不同,呈现各自特征性改变。慢性间歇性低氧可以使大鼠内皮功能受到影响,其中一个显著性变化就是NO生成减少。ET水平在间歇低氧的作用下也发生变化,VEGF水平没有显著性改变,提示慢性间歇性低氧对血管内皮的通透性影响较小。2.间歇低氧(1%O2,37℃,30h,再21%O2,37℃,18h)可以使内皮细胞产生氧化应激损伤。不同程度的氧化应激对细胞的损伤程度不同。本实验中,800μmol/LH2O2干预30h血管内皮细胞损伤最严重。低氧复合氧化应激比单独任一因素对细胞的损伤都大。间歇低氧可能对低氧所致的血管内皮细胞功能损伤有所修复。3.正常和低氧条件下,胆碱均有促大鼠主动脉内皮细胞增殖的作用,且胆碱对血管内皮细胞的低氧损伤有保护作用,其作用机制可能与促进VEGF分泌相关。胆碱可能是通过激活α7 n Ach R这一靶点促进主动脉内皮细胞增殖的。