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番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒(MDPV)引起的主要感染番鸭的一种疫病,以喘气、脚发软、腹泻和进行性消瘦为主要特征；2012年,上海郊区一番鸭养殖场19日龄小番鸭发病,死亡率为50%,病鸭临床症状及病理解剖与经典细小病毒病相似,但该次发病急,死亡率高。疑似由MDPV变异引起；针对该次发病的特点,研发新的检测方法很有必要。本研究根据GenBank上已有的MDPV和GPV序列,设计了7对引物,对采集的病料进行PCR扩增,得到相关的片段后经DNAStar拼接成全基因序列；与GenBank上登陆的已有MDPV相比,该毒株的基因存在一定的差异,与MDPVFM株的同源性仅为93.7%,确定为MDPV变异株,命名为SAAS-SHNH;经分析,SAAS-SHNH株基因组全长为5061nt,包括5’和3’端末端重复序列(ITR),长度为381nt；非结构蛋白基因NS1 (512nt-2395nt)和[NS2 (1040nt-2395nt);结构蛋白基因VP1 (2414nt-4612nt), VP2 (2849nt-4612nt) 和 VP3(3008nt-4612nt)。将SAAS-SHNH株与GenBank登录的MDPV和GPV基因序列分析,发现该毒株有两个区域与GPV发生基因重组,第二个发生基因重组的区域占整个VP3全基因的70%。根据得到的SAAS-SHNH株的全基因序列,设计了一对特异性引物,利用PCR技术扩增全长VP3基因(1605nt),并亚克隆于pET28a构建pET28a-VP3原核表达载体。经浓度为1.00mmoL/L的IPTG诱导后得到包涵体形式的VP3重组蛋白,蛋白大小约63.1kDa；重组蛋白经His-Taq镍柱纯化,浓缩到lmg/mL后免疫新西兰大白兔,49d后血清抗体滴度达到1：105,且能与VP3蛋白和MDPV疫苗株发生特异结合。MDPV抗体检测的IFA方法：根据从病料中分离得到的MDPV,经番鸭胚传代后,接种到原代鸭胚成纤维细胞(DEF),经细胞增殖病毒后,观察细胞病变；将原代鸭胚成纤维细胞按照1×106/mL铺于6孔板,培养12h后待6孔板铺满细胞80%后,铺上病毒,37℃吸附1h,吸去病毒液,加入细胞维持液,4d后加入血清和一抗,设未感染病毒的DEF细胞对照,荧光显微镜下观察,建立免疫荧光方法。结果显示：MDPV出现明显的细胞病变效应,细胞状态变差,细胞变长,变细。IFA实验可检测到免疫荧光信号。经荧光显微镜观察,VP3病毒颗粒存在于细胞质和细胞核中。