论文部分内容阅读
家蚕二分浓核病毒（BmBDV）原称为家蚕浓核病毒Ⅱ型（Bombyx moriDensovirus typeⅡ，BmDNV-Ⅱ），致使家蚕罹患浓核症，在发病的早期感染家蚕中肠柱圆筒状细胞，在发病的后期也能感染杯状细胞。BmBDV病毒粒子无囊膜，呈球形颗粒，球形粒子直径大约在22 nm左右。BmBDV是由单链线性双分子DNA(VD1和VD2)构成，分别独立包装于病毒衣壳中。该病毒拥有独立包装的双分子ssDNA基因组、并且自身编码DNA聚合酶，是首例二分DNA病毒。2012年国际病毒分类委员会专门为此设立了二分DNA病毒科，下设二分浓核病毒属，并将BmBDV定为该属的代表种。 由从蚕粪中纯化的成熟病毒颗粒中含有7个结构蛋白，其中，主要结构蛋白VP由VD1-ORF3编码，次要结构蛋白P133是由VD2-ORF1编码。BmBDV的VD1-ORF3转录产生一种成熟的mRNA，在纯化的病毒粒子中检测到了两种不同分子量的VP蛋白（大小约为50kD），BmBDV通过何种方式表达产生VP蛋白尚不清楚。另外，BmBDV病毒粒子的特征研究仍然处于初级阶段，尚未得到病毒粒子精细的三维结构。 因此为了进一步了解BmBDV的VP蛋白的表达策略、检测VP蛋白自组装情况及获得BmBDV病毒样颗粒。本实验主要从一下三个方面进行研究:(1)通过Western blot检测BmBDV的主要结构蛋白VP的序列特征及在宿主中的表达时相。(2)利用杆状病毒表达系统，分别构建和表达Multibac-vp1和Multibac-vp2，通过Western blot检测蛋白的表达情况;(3)大量表达Multibac-vp1和Multibac-vp2，通过提取纯化获得大量BmBDV病毒样颗粒，并进行电镜观察，质谱鉴定VLPs的构成组分。通过对病毒蛋白主要结构蛋白VP表达和组装的研究为病毒VP蛋白的表达策略解析、病毒结构的解析以及家蚕浓核病的防治奠定基础。 1.BmBDV的主要结构蛋白VP的序列特征及在宿主中的表达时相 VP蛋白的二级结构中含有大量α螺旋、延伸链、β转角以及无规卷曲，由延伸链所构成的β折叠结构与浓核病毒结构蛋白的高级结构相似，可能也能够构成浓核病毒结构蛋白VP中经典的β桶结构。 对BmBDV的主要衣壳蛋白VP在家蚕中的表达时相进行分析，病毒感染家蚕后36小时检测到3种VP蛋白的表达，在感染72小时后进入表达高峰期，在120h时，VP蛋白在中肠组织中的含量最高，感染120 h后，VP蛋白在中肠细胞中的含量减少，可能是由于大量中肠细胞破裂，大量成熟病毒粒子产生并释放，组织中的VP蛋白含量减少。 2.BmBDV结构蛋白基因vp的真核表达 克隆BmBDV编码VP蛋白的序列全长(BmBDV-vp1)及5端截短（从第二个其起始码子ATG开始即BmBDV-vp2）的序列。利用杆状病毒Multibac表达系统在Sf9细胞中对这两段序列进行真核表达，并用Western blot分别检测Multibac-vp1和Multibac-vp2的表达情况。显示BmBDV-vp1表达产生了三个蛋白大小分别约为55 kD、54 kD和51kD（蛋白VP1、VP1和VP2），与病毒在家蚕组织中表达的三个蛋白大小相似，其中VP1和VP2分别与预测从ORF3第一个和第二个起始密码子起始翻译的蛋白大小一致。BmBDV-vp2表达产生了两个蛋白，大小约为51kD(蛋白VP2)和37 kD，其大小分别与预测从ORF3第二个和第三个起始密码子起始翻译的蛋白大小一致。 3.BmBDV病毒样颗粒的提取纯化、结构及其组分鉴定 利用蔗糖密度梯度离心和氯化铯密度梯度离心对Multibac-vp1和Multibac-vp2表达的VP蛋白进行纯化，并通过透射电镜，利用负染法观察VP的自组装VLP的情况并利用质谱鉴定其组成。Multibac-vp1在Sf9细胞中表达产生VP1、VP1和VP2三个蛋白，都参与了病毒样颗粒的组装。同时Multibac-vp2在Sf9细胞中表达产生的VP2和37 kD两个蛋白，参与并自组装为病毒样颗粒。这两种由不同的VP蛋白所组装成的病毒样颗粒其大小和结构与天然的病毒粒子并没有明显的区别，两种VLP都主要是由ORF3编码的VP蛋白构成。Multibac-vp1表达的VP1和VP1以及Multibac-vp2表达产生的VP2都是在VP-ORF的终止密码子终止翻译。