流行病学调查显示,宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation, IUGR)子代成年期代谢性疾病(如肥胖、高血压、2型糖尿病)易感。IUGR和成年期代谢性疾病之间的相关性被认为与“编程”假说相关,即孕期不良环境对胎儿组织结构和功能会产生永久改变, 引起成年期组织器官功能障碍和疾病。下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)轴是机体的重要神经内分泌轴,参与机体的物质代谢以及应激防御反应。流行病学调查、临床研究和动物实验均证实,不良宫内环境易使胎儿HPA轴发育编程改变。且HPA轴的发育改变与成年期疾病的发生密切相关,可能是胎源性成年代谢综合征(如糖尿病、非酒精性脂肪肝)易感的最主要机制,也是系列情感障碍疾病(如抑郁症、精神分裂症等)神经生物学发病机理的“最后共同通路”。饮酒是日常常见生活行为。调查发现,年轻女性饮酒率逐年增加；孕期酒精暴露率有逐年增加趋势；在美国,约50%的孕龄期女性大量饮酒,10%-15%的孕妇会在妊娠期间饮用酒精性饮料。己知乙醇是引起胎儿发育毒性的确切诱因。大量研究表明,孕期乙醇暴露(prenatal ethanol exposure, PEE)涉及一系列子代发育相关的健康问题,如IUGR.成年后神经精神性疾病和代谢综合征的发病率增高。我们前期通过动物实验,系统证实并提出了PEE所致IUGR子代成年代谢性疾病易感的"HPA轴相关神经内分泌代谢编程机制”,即PEE可引起胎儿母源性糖皮质激素(glucocorticoids, GC)过暴露,后者可抑制胎HPA轴功能发育和改变外周糖、脂代谢功能,引起IUGR;且这些改变还可延续到出生后直至成年,表现为高脂饮食下成年子代的HPA轴低基础活性和高应激敏感性,同时HPA轴功能异常还可进一步通过影响外周组织糖、脂代谢改变,在高脂饮食下引起成年代谢性疾病(如非酒精性单纯性脂肪肝)的发生。然而,有关PEE所致IUGR子代HPA轴功能编程改变的发生机制并不清楚。下丘脑室旁核(paraventricular nucleus, PVN)是HPA轴活性的直接调控中枢。海马是HPA轴的重要负调控中枢。谷氨酸(glutamate, Glu)和v-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid,GABA)是哺乳动物脑内重要的兴奋性/抑制性神经递质,两者的动态平衡在维持多脑区(包括下丘脑、海马)功能活动中发挥重要作用。Glu能和GABA能传入信号的重塑是下丘脑室旁核的兴奋/抑制平衡改变的一个潜在机制,而左旋谷氨酸脱羧酶(L-glutamic acid decarboxylase, GAD)在调控Glu/GABA平衡中起着主导作用。有关PEE作用下,子代海马和下丘脑兴奋／抑制神经元失衡及相关调控功能改变并不清楚。已知GC作用于胎组织皮质激素受体(corticoid receptor, CR)不仅有赖于循环中GC水平,而且与胎组织中介导GC代谢的11p-羟类固醇脱氢酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenases,11β-HSDs)系统的表达有关。研究报道,GC可抑制胰岛素样神经生长因子1(insulin-like growth factor 1, IGF1)的表达和分泌。IGF1信号通路参与调节宫内时期各组织的发育、增殖、分化、突触形成、神经保护、抑制神经细胞凋亡、神经再生及能量代谢过程。我们前期己证实,PEE可致胎儿“母源性GC过暴露”。由此我们推测,PEE可能会通过影响胎海马、下丘脑GC代谢活化系统(11β-HSDs/GR/C/EBPa)、IGF1信号通路,介导其突触可塑性和功能改变。在本研究中,我们将重点观察PEE所致的IUGR子代大鼠在出生前、后以及慢性刺激下的HPA轴发育改变,进一步从下丘脑兴奋／抑制性神经元分化以及海马负反馈调控功能层面,探讨PEE所致子代大鼠HPA轴功能发育异常的宫内编程机制。本研究对于深入阐明酒精(乙醇)的发育毒性机制,更好的理解HPA轴相关成年疾病(神经精神性疾病、代谢性疾病)的宫内起源,提高人口生存质量,具有重要的理论价值和现实意义。第一部分孕期乙醇暴露致IUGR子代HPA轴低基础活性和高应激敏感性的宫内起源现象目的：利用整体动物实验,证实PEE所致IUGR子代大鼠出生后HPA轴低基础活性、高应激敏感性改变现象及宫内起源。方法：受孕大鼠于孕9天,随机分为乙醇组和对照组。自妊娠第9日(gestational day 9, GD9)起至GD20,乙醇组每日灌胃给予4 g/kg-d乙醇,对照组给予同等体积生理盐水灌胃。部分孕鼠于孕20天乙醚麻醉下剖腹取胎鼠,称取体重计算IUGR发生率,断头取胎血后显微镜下快速摘取胎下丘脑。以ELISA试剂盒检测胎血皮质酮(corticosterone, CORT)水平,PCR技术检测下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(corticotrophin, CRH)、精氨酸加压素(arginine vasopressin, AVP)、兴奋性神经元转录调控因子和功能蛋白包括配对盒6(Paired box 6, Pax6)、T盒脑蛋白2(T-box brain protein 2, Tbr2)、囊泡谷氨酸转运体2(vesicular glutamate transporter 2, VGluT2)、突触后致密物(Post-synaptic density 95, PSD95)、钙调素依赖性蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ-α,a-CaMKII)以及抑制性神经元转录调控因子和功能蛋白,包括哺乳动物无刚毛鳞甲复合体同源物1 (mammalian achaete-scute homolog-1, Mash1)、左旋谷氨酸脱羧酶(L-glutamic acid decarboxylase, GAD) 65、络丝蛋白(reelin, Reln)的mRNA表达；另一部分孕鼠自然生产,断奶后给予正常饮食。称取仔鼠出生体重及每周体重,计算IUGR率及出生后体重增长率。所有仔鼠出生后第1 1周,随机分为冰水游泳对照组和冰水游泳组,冰水游泳组每天给予5 min冰水(5-7℃)游泳,连续2w,最后一次游泳1 h后在乙醚麻醉下断头处死并取血,摘取下丘脑。放射免疫酶联法检测血促肾上腺皮质激素释放激素(adrenocorticotrophic hormone, ACTH)水平,ELISA方法检测血CORT水平,实时定量PCR技术检测下丘脑CRH、AVP、VGluT2、PSD95、α-CaMKII、GAD65以及Reln的mRNA表达。结果：对于雄性子代：(1)成年仔鼠：①体重及IUGR率：与对照组相比,PEE组出生体重显著减轻(P<0.01),IUGR率显著增加(P<0.01),出生后12周内体重显著减轻(P<0.01),体重增长率无明显改变。②HPA轴活性：与对照组相比,慢性刺激前,PEE组血ACTH、 CORT水平及下丘脑AVP的mRNA表达均显著降低(P<0.05)；慢性刺激后,血CORT、 ACTH水平及下丘脑CRH、AVP的mRNA表达均显著升高(P<0.05,P<0.01)。③下丘脑兴奋性／抑制性神经元功能蛋白：与对照组相比,慢性刺激前、后,PEE组下丘脑GAD65、 Reln的mRNA表达均显著降低(P<0.05),VGluT2/GAD65表达比均显著增加(P<0.05),m]VGluT2、PSD95、CaMKII未见明显改变。(2)胎鼠：①体重及胎血CORT水平：与对照组相比,PEE组体重显著减轻(P<0.01),IUGR率显著升高(P<0.01),胎血CORT水平显著升高(P<0.01)。②HPA轴活性及下丘脑兴奋性/抑制神经元分化：与对照组相比,PEE组胎下丘脑AVP、Mash1、GAD65及Reln的mRNA表达均显著降低(P<0.05),VGluT2/GAD65表达比显著增加(P<0.05), Pax6 (P=0.078)、Tbr2 (P=0.079)、PSD95 (P=0.070)和a-CaMKII (P=0.082)有降低趋势。对于雌性子代：(1)成年仔鼠：①体重及IUGR率：与对照组相比,PEE组出生体重显著减轻(P<0.01),IUGR率显著增加(P<0.01),出生后12周内体重显著减轻(P<0.01),体重增长率无明显改变。②HPA轴活性：与对照组相比,PEE组慢性刺激前血ACTH、 CORT水平及下丘脑CRH、AVP的mRNA表达均显著降低(P<0.05,P<0.01),慢性刺激后血CORT、ACTH水平及下丘脑CRH、AVP的mRNA表达均显著升高(P<0.05,P<0.01)。③下丘脑兴奋性／抑制性神经元分化：与对照组相比,PEE组慢性刺激前下丘脑GAD65、Reln的mRNA表达显著降低(P<0.05),VGluT2/GAD65表达比显著增加(P<0.05),兴奋性神经元功能蛋白无明显改变；慢性刺激后下丘脑GAD65、Reln的mRNA表达显著降低(P<0.01),VGluT2/GAD65表达比显著增加(P<0.01),兴奋性神经元功能蛋白无明显改变。(2)胎鼠：①体重及IUGR率、胎血CORT水平：与对照组相比,PEE组的胎鼠体重显著减轻(P<0.01),IUGR率显著升高(P<0.01),胎血CORT水平显著升高(P<0.01)。②HPA轴活性及下丘脑兴奋性/抑制性神经元分化：与对照组相比,PEE组的胎下丘脑CRH、AVP、Mash1、GAD65、Reln的mRNA表达均显著降低(P<0.05,P<0.01),VGluT2/GAD65表达比显著增加(P<0.05)。结论：PEE所致雄、雌性IUGR子代大鼠呈现HPA轴低基础活性和高应激敏感性改变,并存在宫内起源现象,具体表现为子代出生前下丘脑功能发育抑制(下丘脑CRH和AVP的表达抑制)及潜在高敏感性改变(下丘脑兴奋性／抑制性神经元分化失衡和VGluT2/GAD65表达比值的上调),这些可延续至出生后,由此介导其HPA轴低基础活性(血ACTH水平降低及下丘脑CRH、AVP的表达抑制)和高应激敏感性(慢性刺激后下丘脑CRH、AVP表达增加、血ACTH、CORT水平升高、兴奋性／抑制性神经元分化失衡及VGluT2/GAD65表达比值的上调)。第二部分孕期乙醇暴露致IUGR子代HPA轴低基础活性的宫内编程机制目的：利用整体动物实验,通过观察PEE所致IUGR子代大鼠出生前、后下丘脑局部GC代谢活化系统、GAD67表达及兴奋性/抑制性神经递质平衡、IGF1信号通路、突触可塑性及形态组织学改变,探讨PEE致子代HPA轴低基础活性的宫内编程机制。方法：孕鼠及处理方式同第一部分。一部分孕20天的孕鼠乙醚麻醉下剖腹取胎鼠,快速摘取胎下丘脑,每组取3个全脑固定,实时定量PCR技术检测胎下丘脑GC代谢活化系统(11βHSD1、11βHSD2、GR、C/EBPα)、GAD67、IGF1信号通路(IGF1、IGF1R、 AKT1)、突触可塑性相关蛋白(synaptotagmin 1、synapsin 1)及抑制性受体(GABA-A-β1R、 GABA-A-β2R)的、mRNA表达变化,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色观察下丘脑形态学改变,透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察胎下丘脑组织学改变,免疫组化法观察胎下丘脑GAD67表达变化,免疫荧光法观察胎下丘脑兴奋性／抑制性(glutamatergic/GAB Aergic)神经元活性变化。另一部分孕鼠自然生产后,所有子代采用正常饮食饲养,出生后第85天在乙醚麻醉下处死,快速摘取下丘脑,每组取3个全脑固定,同前实时定量PCR技术检测下丘脑GC代谢活化系统、GAD67、 IGF1信号通路、突触可塑性相关蛋白及抑制性受体的mRNA表达变化,生化和ELISA技术分别检测下丘脑组织神经递质(GABA、Glu)含量,免疫组化法观察下丘脑GAD67表达变化,HE染色观察下丘脑形态学改变。结果：对于雄性子代：(1)成年仔鼠：①下丘脑GC代谢活化系统：与对照组相比,PEE组下丘脑11PHSD1/11βHSD2表达比显著升高(P<0.05),C/EBPa的]mRNA表达显著下调(P<0.05),GR表达无明显改变。②下丘脑GAD67表达、神经递质含量：与对照组相比,PEE组下丘脑GAD67的mRNA及蛋白水平均显著增加(P<0.05,P<0.01),Glu含量显著减少(P<0.05),GABA含量显著增加(P<0.05)。③下丘脑IGF1信号通路、突触可塑性及形态：与对照组相比,PEE组血IGF1水平有上调趋势(P=0.08)、下丘脑IGF1、AKT1、synapsin1、synaptotagmin1、GABA-A-β2R的mRNA表达均显著上调(P<0.05),下丘脑形态学未见明显改变。(2)胎鼠：①下丘脑GC代谢活化系统：与对照组相比,PEE组11βHSD2、C/EBPα的mRNA表达均显著上调(P<0.01),GR有上调趋势(P=0.062),11βHSD1/11βHSD2表达比未见明显改变。②下丘脑GAD67、兴奋性／抑制性神经元活性：与对照组相比,PEE组下丘脑GAD67的mRNA及蛋白表达水平均显著上调(P<0.05,P<0.01),Glu能神经元活性显著降低(P<0.05),GABA能神经元活性显著增加(P<0.01)。③下丘脑IGF1信号通路、突触可塑性及形态：与对照组相比,PEE组血IGF1水平显著降低(P<0.05),下丘脑IGF1、IGF1R、AKT1、synaptotagmin 1、synapsin 1、GABA-A-β1R、GABA-A-β2R的mRNA表达水平均显著升高(P<0.01,P<0.05),下丘脑形态学未见明显改变,电镜下可见下丘脑神经元少数内质网扩张成池。对于雌性子代：(1)成年仔鼠：①下丘脑GC代谢活化系统：与对照组相比,PEE组下丘脑GR及11βHSD1/11βHSD2表达比均显著下调(P<0.05),11βHSD1有下调趋势(P=0.060)。②下丘脑GAD67、兴奋性／抑制性神经元活性：与对照组相比,PEE组下丘脑GAD67的]mRNA及蛋白水平均显著上调(P<0.05),Glu含量显著减少(P<0.05),GABA含量显著增加(P<0.05)。③IGF1信号通路、突触可塑性及形态：与对照组相比,PEE组血IGF1水平显著增加(P<0.01),下丘脑IGF1信号通路、突触可塑性相关蛋白及抑制性受体表达均无明显改变,下丘脑形态学未见明显改变。(2)胎鼠：①下丘脑GC代谢活化系统：与对照组相比,PEE组下丘脑11βHSD1、GR、C/EBPa及11βHSD1/11βHSD2表达比均显著上调(P<0.05,P<0.01)。②下丘脑GAD67、兴奋性／抑制性神经元活性：与对照组相比,PEE组下丘脑GAD67的mRNA及蛋白水平均显著上调(P<0.05),Glu能神经元活性显著降低(P<0.05),GABA能神经元活性显著增加(P<0.05)。③下丘脑IGF1信号通路、突触可塑性及形态：与对照组相比,PEE组血IGF1水平显著减少(P<0.05),下丘脑IGF1、synaptotagmin 1、synapsin 1的mRNA表达均显著下调(P<0.05),AKT1的mRNA表达有下调趋势(P=0.067),抑制性受体无显著性改变,下丘脑形态学未见明显改变,电镜下可见下丘脑神经元内质网扩张成池,伴脱颗粒,高尔基体肥大。结论：PEE所致的胎血高GC可作用于胎下丘脑GC代谢活化系统(11βHSDs/GR/C/EBPα),引起雄、雌性胎下丘脑发生不同程度的GC代谢活化。其中,雄性子代胎下丘脑神经元GC代谢活化/灭活并存,GR介导的GAD67高表达编程改变,可诱导Glu向GABA转化,进而抑制CRH神经元的兴奋性及功能发育；雌性子代胎下丘脑神经元GC代谢活化介导的GAD67高表达编程改变和IGF1信号通路的低表达编程改变,可致CRH神经元的功能抑制及发育不良。这些改变均可导致子代下丘脑CRH及AVP表达降低及功能异常,由此介导HPA轴低基础活性的编程改变。第三部分孕期乙醇暴露致IUGR子代HPA轴高应激敏感性的宫内编程机制目的：利用整体动物实验,通过观察PEE所致IUGR子代大鼠出生前、后海马局部GC代谢活化系统、GAD67表达及神经递质平衡、IGF1信号通路、突触可塑性功能变化及海马形态组织学改变,探讨PEE致子代HPA轴高应激敏感性的宫内编程机制。方法：孕鼠及处理方式同第一部分。一部分孕20天的孕鼠乙醚麻醉下剖腹取胎鼠,快速摘取胎海马,每组取3个全脑固定,实时定量PCR技术检测胎海马GC代谢活化系统、GAD67、IGF1信号通路、突触可塑性相关蛋白及兴奋性受体(离子型N-甲基-D-天冬氨酸-谷氨酸受体(N-methyl-D-aspartate-subtype glutamate receptor, NR)1、NR2A、 NR2B)的mRNA表达变化,亚硫酸氢盐修饰后测序法(Bisulfite Sequence PCR, BSP)检测胎海马GAD67启动子区甲基化水平,HE染色观察海马形态学改变,TEM观察胎海马组织学改变,免疫组化法检测胎海马GAD67表达变化,免疫荧光法观察胎海马兴奋性／抑制性(glutamatergic/GABAergic)神经元活性变化。出生后第85天,在给予5 min冰水游泳刺激实验1h后,冰水游泳对照组及冰水游泳组大鼠均在乙醚麻醉下处死,快速摘取海马,实时定量PCR技术检测海马GC代谢活化系统、GAD67、IGF1信号通路、突触可塑性相关蛋白及兴奋性受体的mRNA表达变化,生化和ELISA技术检测海马组织Glu和GABA含量,每组各取3个全脑固定后,HE染色法观察海马形态学改变,免疫组化法检测海马GAD67的表达改变,免疫荧光法观察海马glutamatergic/GABAergic神经元活性变化。结果：对于雄性子代：(1)成年仔鼠：①海马GC代谢活化系统：与对照组相比,慢性刺激前,PEE组海马GC代谢活化系统未见明显改变,慢性刺激后PEE组海马11βHSD2、 GR、C/EBPa的mRNA表达均显著增加(P<0.05,P<0.01)。②海马GAD67表达及表观遗传学修饰、神经递质含量及兴奋性/抑制性神经元活性：与对照组相比,慢性刺激前,PEE组海马GAD67的mRNA及齿状回(dentate gyrus, DG)、海马角3(Comu ammonis,CA3)区GAD67蛋白表达水平均显著上调(P<0.05,P<0.01),BSP结果显示,PEE组海马GAD67启动子区-219～-4bp区域总甲基化率显著降低(P<0.01),PEE组海马Glu、GABA含量均无明显改变,Glu能神经元活性显著减弱(P<0.05),GABA能神经元活性显著增强(P<0.05)；慢性刺激后,PEE组海马GAD67的mRNA及DG、CA3区GAD67蛋白水平均显著增加(P<0.05,P<0.01),Glu含量及Glu能神经元活性均显著降低(P<0.05,P<0.01),GABA含量及GABA能神经元活性均显著增加(P<0.05)。③海马IGF1信号通路、突触可塑性及形态：与对照组相比,慢性刺激前,PEE组海马IGF1R、AKT1、 synapsinl的mRNA表达均显著增加(P<0.05,P<0.01),NR1、NR2A、NR2B的mRNA表达均显著降低(P<0.05,P<0.01),海马IGF1表达均无明显改变,海马CA3区有少量神经元核浓缩、深染；慢性刺激后,PEE组海马IGF1、IGFIR、AKT1的mRNA表达均显著降低(P<0.05),synapsin1的mRNA表达显著增加(P<0.05),海马CA3区仍有少量神经元核浓缩、深染。(2)胎鼠：①海马GC代谢活化系统：与对照组相比,PEE组胎海马11βHSD2、GR、C/EBPα表达均显著上调(P<0.05,P<0.01),11PHSD1/11βHSD2表达比显著下调(P<0.05)。②海马GAD67、神经递质含量及兴奋性/抑制性神经元活性：与对照组相比,PEE组胎海马GAD67的mRNA及DG、CA3区蛋白水平均显著上调(P<0.05),BSP结果显示,PEE组胎海马GAD67启动子区-219～-4bp区域总甲基化率显著降低(P<0.05),Glu能神经元活性显著降低(P<0.05),GABA能神经元活性显著增加(P<0.01)。③海马IGF1信号通路、突触可塑性及形态：与对照组相比,PEE组胎海马IGF1、IGF1R、AKT1、synapsin1、NR1、NR2A、NR2B的mRNA表达均显著上调(P<0.05,P<0.01),海马形态学未见明显改变,电镜下可见胎海马少数内质网扩张成池,高尔基肥大。对于雌性子代：(1)成年仔鼠：①海马GC代谢活化系统：与对照组相比,慢性刺激前,PEE组海马11βHSD1/11βHSD2表达比显著下调(P<0.05),GR、C/EBPα未见明显改变；慢性刺激后,PEE组海马11βHSD1、GR、C/EBPα的]mRNA表达均显著上调(P<0.05, P<0.01),11βHSD1/11βHSD2表达比显著上调(P<0.01)。②海马GAD67、突触可塑性及兴奋性／抑制性(glutamatergic/GABAergic)神经元活性：与对照组相比,慢性刺激前,PEE组海马GAD67的]mRNA及蛋白水平、Glu及GABA组织含量、Glu能神经元及GABA能神经元活性均无显著性改变：慢性刺激后,PEE组海马GAD67的mRNA及蛋白水平均无显著改变,Glu及GABA组织含量、Glu能神经元及GABA能神经元活性均显著降低(P<0.05)。③海马IGF1信号通路、突触可塑性及形态：与对照组相比,慢性刺激前,PEE组海马IGF1、NR1的mRNA表达显著降低(P<0.05),synapsinl的mRNA表达显著升高(P<0.05),AKT1、NR2A表达有降低趋势(P=-0.063,P=0.082),海马CA3区有少量神经元核浓缩、深染；慢性刺激后,PEE组海马IGF1、IGF1R、AKT1的mRNA表达均显著降低(P<0.05),NR1、NR2B、synapsin1的mRNA表达均显著增加(P<0.05),海马CA3及DG区均有少量神经元核浓缩、深染。(2)胎鼠：①海马GC代谢活化系统：与对照组相比,PEE组胎海马11βHSD1、GR、C/EBPα及111βHSD1/11βHSD2表达比均显著上调(P<0.05,P<0.01),11βHSD2表达无显著性改变。②海马GAD67、兴奋性／抑制性神经元活性：与对照组相比,PEE组胎海马GAD67的mRNA及蛋白水平均无显著改变,Glu能神经元活性显著降低(P<0.05),GABA能神经元活性无明显改变。③海马IGF1信号通路、突触可塑性及形态：与对照组相比,PEE组胎海马IGF1、GF1R、AKT1均显著下调(P<0.05,P<0.01),synapsin1、NR1、NR2A、NR2B的mRNA表达均显著上调(P<0.05,P<0.01),海马形态学未见明显改变,电镜下可见胎海马少数内质网扩张成池,高尔基肥大。结论：PEE所致胎血高GC可作用于胎海马GC代谢活化系统,引起雄、雌性胎海马发生不同程度的GC代谢活化。对于雄性子代,GC代谢活化可通过高表达GR介导的胎海马GAD67启动子-219-4区域去甲基化和GAD67高表达编程改变,使海马G1u向GABA转化增加；对于雌性子代,可通过高表达C/EBPa介导的胎海马IGF1信号通路低表达编程改变,进一步引起海马发育不良及Glu释放减少。这些改变均可导致海马对终纹床核投射到下丘脑视旁核(PVN)的GABA能神经纤维的激动效应减弱,引起下丘脑兴奋性／抑制性神经元分化失衡。这些改变均可延续到出生后,并在慢性应激下表现为HPA轴高敏感性变化。