肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)是一种免疫炎症性疾病，主要病理类型有微小病变(minimal change disease，MCD)、局灶节段硬化性肾小球肾炎(focalsegmental glomerulosclerosis，FSGS)、膜性肾病(membranous nephropathy，MN)和系膜增生性肾炎。糖皮质激素(glucocorticoid，GC)是治疗的首选，患者对GC的反应性各不相同，对激素敏感患者的尿蛋白可以在使用足量激素治疗后8周内转阴；而对激素抵抗的患者激素治疗8-12周后，尿蛋白仍无明显减少。激素抵抗型患者预后差，病情易迁延反复，最终进入至终末期肾病；另外患者由于承受了大剂量激素治疗，易导致激素相关副作用造成病情加重。目前，NS激素抵抗的发生机制仍不清楚，因此，研究激素抵抗的发生机制，寻找激素抵抗的早期生物学标志物，是肾脏病研究领域的重点问题之一。　　 我们课题组前期工作中应用比较蛋白质组学方法发现了与NS激素抵抗相关的血清差异蛋白——结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)。Hp是血清球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白，广泛存在于人类和许多哺乳动物血清和其他体液中，在肝脏、肺脏、皮肤、脂肪组织等多个脏器和组织也检测到Hp的表达。Hp是急性期蛋白之一，具有多种功能，引起许多学者的高度重视。研究者发现多种免疫细胞上都有Hp的受体，但Hp的免疫调节功能相对复杂，既有正向调控也有负向调控。如Hp可促进T、B淋巴细胞的增殖与功能分化；可以调节Th1/Th2平衡；能抑制表皮内的朗格汉斯细胞免疫功能成熟等。Hp免疫调节的具体作用尚存争议，没有定论。　　 GC强大的抗炎作用使其成为临床肾脏疾病的常规用药。目前认为，GC主要通过与胞浆中的糖皮质激素受体(glucocorticoid recepter，GR)结合，随后GC-GR复合物转位入细胞核，与靶基因上的糖皮质激素反应元件(glucocorticoidresponse element，GRE)相结合并增加或减少靶基因的表达来抑制炎症。GC与GR结合是GC作用的前提，有关激素抵抗的机制研究也多集中于GR方面，主要是GRα和GRβ。GRα可与GC结合并使其发挥生物学效应，GRβ不与GC结合，它能抑制GRα的活性。有研究显示GC的生物学效应受GRα与GRβ的数量、比例以及受体的亲和力的影响。而脂皮素-1(lipocortin-1，LC-1)是GC可以直接上调表达的抗炎介质之一，能介导GC的抗炎作用，在本研究中作为GC抗炎效应的指针。　　 目前普遍认为，免疫功能的紊乱是获得性激素抵抗的重要机制之一。同时，已有研究表明Hp具有免疫调节的作用。我们推测Hp可能通过其免疫调节作用进而参与激素抵抗的发生，因此，本课题将探讨Hp对激素治疗效应究竟存在何种作用及其可能机制。　　 第一部分、检测NS患者血中Hp水平　　 目的：　　 对前期工作中寻找出的差异蛋白Hp做进一步验证。　　 材料和方法：　　 2007年9月至2009年12月间中山大学附属第一医院肾内科的住院患者87例及健康志愿者52例。所有患者在采集血标本时均未开始接受肾上腺皮质激素和(或)免疫抑制剂治疗，经临床确定诊断为原发性肾病综合征，其中男72例，女15例。根据后续GC治疗效果将患者分为激素敏感组(5例)与激素抵抗组(37例)。WesternBlot检测各组血清Hp蛋白表达水平。ELISA检测各组血清Hp、C-反应蛋白(Creactive protein，CRP)表达水平。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，QPCR)检测各组外周血单个核细胞中(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)Hp mRNA表达水平。　　 结果：　　 1.Western blot结果显示，激素敏感组和激素抵抗组血清Hp蛋白条带均强于正常对照组血清Hp蛋白条带，激素抵抗组血清Hp蛋白条带强于激素敏感组血清Hp蛋白条带。　　 2.ELISA结果显示，激素敏感组和激素抵抗组血清Hp水平显著高于正常对照组(p＜0.001)，激素抵抗组血清Hp水平显著高于激素敏感组(p＜0.001)。　　 3.ELISA结果显示，激素抵抗组血清CRP水平显著高于正常对照组(p＜0.005)，激素抵抗组与激素敏感组之间血清CRP水平的差异没有统计学意义(p＞0.05)，激素敏感组与正常对照组之间血清CRP水平的差异也没有统计学意义(p＞0.05)。　　 4.QPCR结果显示，与正常对照组相比，激素敏感组和激素抵抗组PBMC中HpmRNA表达水平均呈明显上升趋势，但其升高无统计学意义(p＞0.05)。与激素敏感组相比，激素抵抗组PBMC中Hp mRNA表达水平呈明显上升趋势，但其升高无统计学意义(p＞0.05)。　　 第二部分、Hp干扰地塞米松(dexamethasone，DEX)作用的体外实验　　 目的：　　 研究Hp在NS激素抵抗中的作用及探讨其可能的机制　　 材料和方法：　　 提取正常人(6例)的PBMC接种于48孔板，分为：溶媒对照组、10-5M DEX单独处理组、不同浓度(50ug/ml，200ug/ml，800ug/ml)Hp+DEX共同处理组，800ug/mlHp单独处理组。人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)和人IgG作为Hp的对照蛋白。各组培养6小时后收集细胞，提取细胞总RNA，QPCR分别检测各组细胞LC-1mRNA、GRαmRNA、GRβ mRNA、GAPDHmRNA的表达水平。　　 结果：　　 1.QPCR结果显示，DEX上调LC-1 mRNA表达水平的最佳作用时间为6小时，最佳浓度为10-5M。　　 2.QPCR结果显示，与溶媒对照组相比，单独加DEX组PBMC中LC-1 mRNA表达水平显著上调(p＜0.05)；与单独加DEX组比，不同浓度Hp和DEX共培养组PBMC中LC-1 mRNA表达水平显著下调(p＜0.05)；与50ug/ml或200ug/ml Hp和DEX共培养组相比，800ug/ml Hp和DEX共培养组PBMC中LC-1 mRNA表达水平的下调趋势更加明显，但无统计学意义(p＞0.05)；与单独加DEX组相比，不同浓度对照蛋白HSA或人IgG和DEX共培养组均对PBMC中LC-1 mRNA的表达水平无明显影响(p＞0.05)；与溶媒对照组比，独加800ug/ml Hp或对照蛋白人HSA、人IgG组均对PBMC中LC-1 mRNA的表达水平无明显影响(p＞0.05)。　　 3.QPCR结果显示，与溶媒对照组相比，单独加DEX组PBMC中GRαmRNA表达水平显著下调(p＜0.05)，对GRβ mRNA表达水平和GRα/GRβ mRNA比值变化无明显影响(p＞0.05)；与单独加DEX组相比，不同浓度Hp和DEX共培养组均对PBMC中GRαmRNA表达水平、GRβ mRNA表达水平、GRα/GRβmRNA比值的变化无明显影响(p＞0.05)。　　 全文总结：　　 1.肾病综合征患者血清Hp水平显著增高，且激素抵抗组显著高于激素敏感组和正常对照组。　　 2.血清CRP水平在激素敏感组和激素抵抗组无显著差别，血清Hp水平在激素敏感组和激素抵抗组的差别比CRP更有显著性，提示Hp有可能成为肾病综合征激素抵抗的血清生物学标志物。　　 3.体外实验显示，Hp能抑制地塞米松所上调的下游内源性抗炎介质LC-1mRNA的表达，提示Hp可能参与了激素抵抗的发生。　　 4.Hp不是通过改变GRα/GRβ的比值而抑制地塞米松所上调的下游内源性抗炎介质LC-1 mRNA的表达，至于其可能参与激素抵抗的具体机制还有待进一步探讨。