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背景阿尔茨海默病(AD)是较常见的痴呆类型,以进行性认知障碍为临床表现,随病情的逐渐进展会导致不可逆转脑损伤。目前AD已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题之一。AD典型的病理特征是β淀粉样斑块和神经元纤维缠结,目前其病理特征的形成机制尚不清楚。神经炎症是AD病理的基本组成部分。研究发现小胶质细胞(MG)的激活在神经炎症中起着核心作用,抑制MG激活可以缓解Aβ斑块沉积。当MG被过度激活,产生TNF-α、MIP-1α、IL-1等炎症介质,激活促炎因子信号通路引起炎症反应。TLR4/NF-κB是经典炎症通路,TLR4介导My D88依赖性信号通路参与炎症反应。益生菌通过调节肠道菌群参与预防和治疗包括AD在内的多种慢性疾病。青海藏区传统酸奶是由当地农牧民沿用传统发酵方法制作的乳制品,已有研究表明藏区牦牛酸奶具有抗氧化活性,降低胆固醇,提高免疫力的作用。据报道,青海省海南州藏族人群的AD患病率明显低于国内外已报道人群,我们假设藏族人群AD患病率低除了与遗传背景、宗教信仰有关以外,可能与长期进食传统发酵酸奶导致肠道菌群发生变化进而影响AD的患病。为了验证上述假设,本研究拟通过以下三个部分进行探讨:第一部分青海藏区传统发酵酸奶微生物多样性分析目的:采集藏区传统发酵酸奶样本进行微生物分析,筛选乳酸菌资源相对丰富的传统发酵酸奶为下一步实验打下基础。方法:收集不同藏区(海拔>2400m以上)牧民家庭中酸奶样本,采用16s RNA高通量测序法,分析藏区传统发酵酸奶微生物结构组成及多样性。结果:共采集12份合格传统发酵酸奶样本,高通量测序后分类得到16个门,203个属。不同地区样本中的细菌种属存在一定的差异,来自海南藏族自治州共和县的传统发酵酸奶样本(A-1)蕴含的乳酸菌资源及物种丰度相对较高。结论:藏区传统发酵酸奶中蕴含丰富的乳酸菌资源,细菌种属存在地区差异性,A-1酸奶样本物种丰度相对较高。第二部分青海藏区传统发酵酸奶对APP/PS1双转基因AD模型小鼠认知功能及相关蛋白表达的影响目的:通过筛选出物种丰度相对较高的酸奶干预AD模型小鼠,分析其对AD小鼠认知功能及相关蛋白表达情况,以期发现藏区传统发酵酸奶可能对AD模型小鼠认知功能影响的作用机制。方法:选取2月龄AD模型小鼠随机分为三组:(1)模型对照组(APP/PS1组;n=12);(2)乳酸杆菌干预组(Lac.组;n=12);(3)藏区传统发酵酸奶干预组(Yogurt组;n=12)。同背景野生型为正常对照组(WT组;n=12),四组小鼠每日灌胃一次,持续140d。干预结束后,进行水迷宫(MWM)以及新物体识别实验(NORT)观察藏区酸奶对AD模型小鼠认知功能的影响;ELISA法测定量小鼠血清Aβ水平;免疫组织化学法观察海马及皮层Aβ表达水平;免疫印迹法检测Aβ蛋白表达情况以及TLR4/y D88/NF-KBp65信号通路中关键蛋白的表达情况;HE染色观察不同组小鼠肠道结构变化。结果:连续140d藏区酸奶干预后,可缩短水迷宫实验中AD模型小鼠寻找平台的潜伏期、穿越平台的次数以及目标象限停留的时间(P<0.05);增加AD模型小鼠新物体识别实验中的识别指数(P<0.05);可降低AD模型小鼠血清及脑内Aβ水平(P<0.05);下调TLR4、My D88、NF-κBp65、p-IκB蛋白水平的表达,抑制TLR4/My D88/NF-KB信号通路的激活。四组肠组织病理观察,可改善肠粘膜上皮结构。结论:藏区传统发酵酸奶干预可以通过调节炎症通路相关蛋白的表达,改善AD模型小鼠的学习记忆能力及脑内Aβ沉积。其具体的机制可能是通过下调TLR4、My D88、NF-κBp65、p-IκB蛋白水平,减少炎症反应,抑制TLR4/y D88/NF-κB信号通路的激活,从而减少脑内Aβ沉积,改善学习记忆能力。第三部分青海藏区传统发酵酸奶对APP/PS1双转基因AD模型小鼠肠道微生物的影响目的:肠道菌群紊乱在AD发病中起重要作用。因此,基于第一及第二部分实验结果,进一步探讨藏区传统发酵酸奶通过调节肠道菌群改善AD模型小鼠的作用机制。方法:以AD模型小鼠及同背景野生小鼠为研究对象,分别于干预前及灌胃140d后2个时间段,收集四组小鼠粪便样本(每组5~8只),提取各组小鼠粪便DNA,进行16S r RNA高通量测序。根据测序结果分析各组小鼠肠道菌落组成、物种相对丰度及多样性;通过小鼠行为学数据及肠道微生物OTU聚类结果进行Spearman相关性分析。结果:1、与正常野生小鼠相比,AD模型小鼠肠道微生物群落丰富度及多样性降低;2、不同处理组的AD模型小鼠粪便菌落在物种丰富度及微生物多样性存在明显差异。APP/PS1组小鼠粪便微生物群落多样性及丰度较Yogurt组和Lac.组小鼠低,差异有统计学意义(P<0.05)。从粪便菌群整体结构上看,在门水平,Yogurt组和Lac.组中的厚壁菌门相对丰度低于APP/PS1组,而拟杆菌门的相对丰度高于APP/PS1组,差异有显著意义(P<0.05);在属水平,Mucispirillum,Anaerotruncus和Faecalibacterium在APP/PS1组中的相对丰度高于Yogurt和Lac.组(P<0.05);Bacteroides在APP/PS1组的相对丰度低于Yogurt和Lac.组(P=0.0005);Ruminiclostridium在APP/PS1组肠道群落中的相对丰度高于Yogurt组(P=0.0198);Desulfovibrio相对丰度在APP/PS1组和Yogurt组变化不明显,在Lac.组中增加明显(P=0.0065);Lactobacillus和Alistipes菌属的相对丰度在APP/PS1、Yogurt和Lac.三组中变化不明显(P=0.99,P>0.05)。3、对可能与认知损伤有关的肠道菌落进行了Spearman相关性分析,结果显示在属水平,Mucispirillum,Caproiciproducens,Ruminiclostridium,Lactobacillus,Lachnoclostridium,Candidatus_Arthromitus,Candidatus_Saccharimonas均与认知功能呈现负相关(P<0.05),而Erysipelatoclostridium,Enterorhabdus和Muribaculum则为正相关关系(P<0.05)。其中Mucispirillum相关性最强(SCC=?-0.880)。结论:WT组小鼠肠道微生物群落丰富度及多样性高于AD组;经藏区传统发酵酸奶干预后可提高AD模型小鼠肠道微生物群落的丰富度和多样性;藏区发酵酸奶可能通过增加AD模型小鼠肠道微生物的丰富度及多样性,调节肠道微生物失衡,保护肠粘膜屏障,从而改善认知功能。小鼠认知功能与其肠道菌群具有显著相关性,传统发酵酸奶干预后对其有调整作用。