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背景和目的:肺癌（Lung cancer）在全球范围内仍然是癌症相关性死亡的首位原因,非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最常见的组织病理学类型,约占所有肺癌病例的85%。NSCLC起病隐匿,早期无症状,确诊时多数患者已属晚期,预后欠佳。NSCLC患者总的5年生存率大约15%。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（Epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKIs）是治疗EGFR激活突变阳性晚期NSCLC患者的一线治疗方案,然而绝大多数患者在治疗9～13个月后不可避免地发生耐药,严重削弱了EGFR-TKIs对NSCLC的疗效。有研究表明自噬与EGFR-TKIs耐药密切相关,诱导自噬有助于增加NSCLC细胞对EGFR-TKIs的敏感性。因此从克服EGFR-TKI耐药的角度寻找新的自噬诱导剂显得十分重要。姜黄素是从姜黄根状茎中提取的一类疏水多酚化合物,具有广泛的药理作用,如抗炎、抗氧化及抗肿瘤作用等。埃克替尼是我国自主研发的第一代EGFR-TKI。虽然已有研究显示姜黄素可通过诱导自噬和自噬依赖性凋亡增加NSCLC对EGFR-TKIs的敏感性,但是姜黄素逆转EGFR-TKIs耐药的机制尚未完全阐明。本研究应用体外细胞实验研究,检测姜黄素对埃克替尼抑制EGFR-TKI耐药NSCLC细胞增殖和迁移的增效作用,观察细胞自噬水平的变化,以及自噬抑制剂对这个作用的影响,进一步探讨姜黄素逆转EGFR-TKIs耐药的自噬相关机制。方法:体外培养不同基因背景的NSCLC细胞系,H460（EGFR野生型）、H1975（EGFR L858R+EGFR T790M突变）和HCC827（EGFR 19exon E746-A750缺失突变）,首先用CCK8法分别测定这三个细胞系对埃克替尼和姜黄素的敏感性,计算它们的IC50值。使用自噬抑制剂（3-methyladenine,3-MA）前后分别用不同浓度埃克替尼、姜黄素及两药联合处理这三个NSCLC细胞系24小时,采用CCK-8法检测这些细胞增殖率的变化,细胞划痕实验检测两个NSCLC耐药细胞系迁移能力,Western blotting检测LC3-Ⅱ/I、P62/SQSMT1和Beclin-1自噬蛋白的表达水平变化;免疫荧光检测自噬小体形成。结果:1、不同浓度埃克替尼和姜黄素分别处理H460、H1975、HCC827细胞24 h后,CCK-8法检测结果显示,埃克替尼呈剂量依赖性明显抑制HCC827细胞增殖（P＜0.05）,而对H460和H1975细胞的无显著抑制作用。埃克替尼的IC50值在H1975和H460细胞明显高于HCC827细胞（P＜0.001）。姜黄素对这三个NSCLC细胞系的增殖均呈剂量依赖性的抑制作用（P＜0.05）。姜黄素的IC50值在H1975、H460和HCC827细胞之间的无明显差异。2、用不同浓度埃克替尼分别与5μg/ml及10μg/ml姜黄素联合处理H460和H1975细胞24 h后,应用CCK-8法检测细胞增殖率变化,结果显示姜黄素显著增强了埃克替尼对H460和H1975细胞的增殖抑制作用（P＜0.05）,姜黄素可明显降低埃克替尼的IC50,组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。在相同埃克替尼浓度条件下,随着姜黄素浓度的增加,H460和H1975细胞增殖率进一步下降（P＜0.05）,埃克替尼在10μg/ml姜黄素组的IC50较5μg/ml姜黄素组降低更为明显,组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。3、采用划痕实验评估埃克替尼单药及与姜黄素联合处理对H460和H1975细胞迁移能力影响,设立不给药作为空白对照组。结果显示,与单药组及空白对照组相比,姜黄素与埃克替尼联合明显抑制了H460和H1975细胞的迁移能力,这个过程中姜黄素对埃克替尼的增效作用表现出剂量依赖性。4、分别用5μg/ml埃克替尼、姜黄素（5μg/ml、10μg/ml）和两药联合（5μg/ml埃克替尼+5μg/ml姜黄素、5μg/ml埃克替尼+10μg/ml姜黄素）处理H460和H1975细胞24 h后,Western Blotting法检测自噬相关蛋白的表达水平。结果显示,与单药组及空白对照组相比,两药联合处理明显上调LC3-Ⅱ及Beclin-1蛋白表达,下调P62/SQSMT1蛋白表达（P＜0.05）。5、应用间接免疫荧光法检测经5μg/ml埃克替尼、10μg/ml姜黄素及两药联合处理H460、H1975细胞24 h后自噬小体变化。结果显示,与单药组及空白对照组相比,两药联合组自噬小体LC3-II的表达显著提高（P＜0.05）。6、采用CCK-8法检测使用自噬抑制剂3-MA前后,不同浓度埃克替尼联合10μg/ml姜黄素处理H460和H1975细胞24 h后的增殖率变化。结果显示,在加用自噬抑制剂3-MA处理条件下,埃克替尼联合10μg/ml姜黄素导致的H460和H1975细胞增殖率降低呈现部分但有统计学意义的提高（P＜0.05）。7、分别用5μg/ml埃克替尼+10μg/ml姜黄素、两药联合再加3-MA和单用3-MA处理H460和H1975细胞,设立不给药作为空白对照组,Western Blotting法检测自噬相关蛋白表达。结果显示,在加用3-MA的条件下,埃克替尼联合姜黄素处理H460和H1975细胞24 h后,LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达较其他处理组降低,P62/SQSMT1蛋白表达升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:1、姜黄素能够呈剂量依赖性的抑制H460、H1975、HCC827细胞增殖。2、姜黄素呈剂量依赖性增强了H460和H1975细胞对埃克替尼的敏感性。3、姜黄素可与埃克替尼协同抑制H460和H1975细胞的迁移能力。4、姜黄素和埃克替尼联合明显增强H460和H1975细胞的自噬诱导,提示姜黄素通过与埃克替尼协同诱导了自噬性细胞死亡,从而逆转了NSCLC细胞对埃克替尼的耐药。