NPK1和NPR1基因的克隆及其转化辣椒的研究

来源 :西北农林科技大学 西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xxyty
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辣椒(Capsicum annuum L.)是一种重要的蔬菜作物,具有丰富的营养价值和经济价值,世界各地广泛栽培。但由于恶劣的自然环境如低温、盐碱、高温、干早的影响以及病虫害的频繁发生,降低了辣椒的产量和品质。因此,提高辣椒的抗逆、抗病性已成为重要的研究课题。烟草NPK1基因是参与细胞周期调控的MAPKKK激酶在植物的生长发育调节和抗逆等生理过程中起重要作用,拟南芥NPR1基因是植物系统获得性抗性中的一个关键基因。本试验分别从拟南芥和烟草中克隆NPR1和NPK1基因,并构建了植物表达载体。以8个辣椒(Capsicum annuum L.)品种为材料,对辣椒高频再生体系的建立、影响农杆菌转化的诸因素、再生植株筛选与鉴定进行了较为系统的研究分析。并以辣椒子叶为外植体通过农杆菌介导的遗传转化方法将NPK1和NPR1基因导入辣椒获得转基因再生植株,同时用NPK1基因转化拟南芥。主要结果如下:1.辣椒植株离体再生体系中,较高的6-BA/IAA值有利于辣椒外植体的分化再生,而6-BA/IAA值较低则适合于再生芽的伸长;不同辣椒材料的再生能力差别较大,其中以B4、2096和B7的分化能力最强;辣椒带柄子叶再生能力比下胚轴强,是较好的外植体材料;不同苗龄的子叶再生能力也有差异,以12~16d苗龄的外植体分化频率较高;高频率的不定芽分化培养基为MB(MS无机成分+B5有机成分)+0.8mg/L IAA +5.0mg/L 6-BA +4.0mg/L AgNO3;不定芽伸长的适宜培养基为MB+ 0.8mg/L IAA + 2.0mg/L6-BA + 2.0mg/L GA3 + 4.0mg/L AgNO3;高效生根诱导培养基为MB+0.2mg/L IAA + 0.1mg/L NAA。2.农杆菌介导辣椒遗传转化的适宜条件是12d苗龄子叶外植体,在M1培养基(MB+0.8mg/L IAA+5.0mg/L 6-BA +4.0mg/L AgNO3)预培养2d后,浸没到农杆菌菌液中侵染8-12min,在M1培养基上共培养2d后转移至延迟培养基M2(MB+0.8mg/L IAA +5.0mg/L 6-BA +4.0mg/L AgNO3+250mg/L Cef)延迟选择2d。外植体转移至M3(MB+0.8mg/L IAA+5.0mg/L 6-BA+4.0mg/L AgNO3+250mg/L Cef+50mg/L Km)进行选择培养。3.试验共获得抗性植株65株,PCR检测阳性植株9株,其中转化NPK1基因阳性植株5株,转化NPR1基因阳性植株4株。4.对拟南芥转化NPK1植株进行抗旱分析表明:MDA的含量随着胁迫的加深而增加,抗逆性强的株系其体内MDA的含量较低;与MDA的变化趋势一样,随着胁迫的加深脯氨酸的含量增加,胁迫早期脯氨酸的含量与抗逆性成正相关。
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