研究背景卵巢癌是妇科恶性肿瘤中恶性程度最高的一种,其发病率位于女性生殖系统恶性肿瘤的第三位[1],但其死亡率却位居第一位,且发病率有呈逐年上升之趋势[2]。其中卵巢上皮性癌又是各种类型卵巢癌中发病率和致死率最高的妇科恶性肿瘤[3]。因为卵巢组织位于盆腔深部,大部分卵巢癌患者早期多无明显的自觉症状,同时卵巢癌又缺乏特异性的肿瘤标志物,所以卵巢癌一般发现都多为中晚期。目前,卵巢癌的主要治疗方式为有效的肿瘤细胞减灭手术联合以铂类为基础的标准化疗方案治疗,满意的手术方式能达到最大程度的肿瘤肉眼减灭,但有些转移灶不能通过手术彻底解决。虽然化疗的早期有效率很高,但大部分卵巢癌患者容易出现对化疗药物的耐药,这也就成为卵巢癌治疗效果不满意、复发率和死亡率高、5年存活率仅有30%左右的重要原因[3-8]。因此,寻找卵巢癌新的治疗途径十分必要。如今肿瘤的靶向治疗已成国内外关注的热点,现已有多种分子靶向药物用于恶性肿瘤的治疗,也包括贝伐珠单抗对卵巢癌的靶向治疗[9]。贝伐珠单抗(Bevacizumab,Bev)是一种血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)抑制剂,它是VEGF重组人源化的单克隆抗体。贝伐珠单抗的分子靶向作用机制主要是其与内源性VEGF竞争结合VEGF受体(VEGFR),使与内源性VEGF结合的VEGFR减少,阻断下游信号转导,抑制内皮细胞增殖和新生血管的生成,引起原有肿瘤血管的退化和残存血管的通透性降低[10-12]。贝伐珠单抗在国外卵巢癌的靶向治疗领域中的临床试验已显示出满意的治疗效果,已有大量系统的临床试验报道。但在我们国内,贝伐珠单抗在卵巢恶性肿瘤中的靶向治疗尚缺乏大量的临床资料报道。第四军医大学附属西京医院妇产科对45例初治的卵巢上皮性癌患者进行在化疗的基础上联合贝伐珠单抗靶向治疗,观察经贝伐珠单抗治疗后的近期临床治疗效果和贝伐珠单抗临床使用的安全性。在此基础上采用免疫组化S-P法检测化疗联合贝伐珠单抗靶向治疗后卵巢癌组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达及与微血管密度(MVD)的改变。同时检测第四军医大学附属西京医院妇产科收治的98例手术(正常卵巢20例、化疗50例及Ⅰ、Ⅱ期手术28例)患者的卵巢组织石蜡块中VEGF和CD34的表达,计算MVD值,进行统计学分析,观察VEGF和MVD在卵巢上皮性癌中的临床病理特征及两者之间的相关性。贝伐珠单抗在国外上市的十余年里,已在如肺癌,转移性结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中得以应用,且2004年美国食品药物管理局(America Food Drug Administration,FDA)已批准Bev作为治疗转移性结肠癌的靶向治疗药物,在欧美地区,贝伐珠单抗在卵巢癌中的Ⅱ、Ⅲ期临床试验研究已很成熟,目前欧洲药品管理局(European Medicines Agency,EMA)已根据GOG 0218及ICON7的研究结果,批准贝伐珠单抗用于新确诊的晚期卵巢癌的一线治疗[13-15],该批准对受限于手术治疗和化疗的卵巢癌患者而言多了一种选择。虽然贝伐珠单抗已在中国国内上市,但有关贝伐珠单抗在国内卵巢癌患者治疗中的临床试验数据报道不多。同时,贝伐珠单抗对人卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的体外实验文献报道不多,有文献指出[16]:通过CCK-8(Cell Count Kit-8)法检测发现:贝伐珠单抗不影响人卵巢癌SKOV3细胞的活力及生存能力。但又有文献报道[17]:在体外实验中,贝伐珠单抗能有效地降低人卵巢癌SKOV3细胞的增值指数,并且能促进SKOV3细胞的凋亡。本实验以入组的卵巢上皮性癌患者的影像学资料、血清学CA125值的变化和分组的卵巢上皮性癌组织的石蜡切片及人卵巢癌SKOV3细胞株为实验研究对象,采用统计学方法对入组的PT(奈达铂+多西他赛)化疗组和PT化疗联合贝伐珠单抗靶向治疗组的卵巢上皮性癌患者进行近期临床效果分析评估,并观察贝伐珠单抗的临床使用安全性。采用免疫组化S-P法检测分组的卵巢组织石蜡切片中VEGF的表达。用CD34标记血管内皮细胞,观察CD34蛋白的表达,计算微血管密度(MVD)值。分析VEGF和MVD之间的相关性,并分析它们的表达与临床病理之间的关系。选择合适的贝伐珠单抗和顺铂的使用浓度,分别单独作用人卵巢癌SKOV3细胞,加药24h、48h后用CCK-8法检测卵巢癌SKOV3细胞的增殖情况;用流式细胞技术检测贝伐珠单抗组人卵巢癌SKOV3细胞的24h凋亡率。选取合适的药物浓度(贝伐珠单抗150μg/ml,顺铂3μg/ml)后二者再进行联合用药,加药24h、48h之后用CCK-8法检测SKOV3细胞的增殖情况,用流式细胞技术检测联合用药24h细胞凋亡率。观察贝伐珠单抗对人卵巢癌SKOV3细胞及组织的生物学影响。目的1.观察贝伐珠单抗靶向治疗后卵巢上皮性癌患者的临床治疗效果;2.观察卵巢上皮性癌组织石蜡切片中VEGF的表达,用CD34标记血管内皮细胞,观察CD34的表达,计算微血管密度(MVD)值,分析VEGF和MVD之间的相关性,并分析它们的表达与临床病理之间的关系;3.检测贝伐珠单抗和顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响;4.探讨贝伐珠单抗对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用。方法及内容1.与PT方案化疗对比,观察PT联合贝伐珠单抗靶向治疗卵巢上皮性癌患者的近期临床治疗效果,并评价贝伐珠单抗的临床安全性;2.检测VEGF和MVD分别在正常卵巢组、早期手术组、PT化疗组、及PT+Bev组卵巢组织石蜡切片中的表达,分析VEGF和MVD之间的相关性,并分析它们的表达与临床病理之间的关系;3.检测不同浓度的贝伐珠单抗(50μg/ml,100μg/ml,150μg/ml,200μug/ml)和不同的顺铂使用浓度(1.5μg/ml,3μg/ml,6μg/ml,9μg/ml)分别单独作用于人卵巢癌SKOV3细胞,加药24 h、48 h后用CCK-8法检测人卵巢癌SKOV3细胞的增殖情况;用流式细胞仪检测贝伐珠单抗组人卵巢癌SKOV3细胞的24h凋亡率;4.选取合适的药物浓度(贝伐珠单抗150μg/ml,顺铂3μg/ml),二者进行联合用药,加药24 h、48 h后用CCK-8法检测细胞的增殖情况;用流式细胞术检测SKOV3细胞的24h细胞凋亡率;5.观察贝伐珠单抗联合顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用。结果:1.观察近期临床治疗效果及不良反应:入组的所有患者至少完成6-8个周期的PT方案化疗,PT化疗联合贝伐珠单抗靶向治疗至少3-6个周期,所有患者均可评价近期临床疗效、血清学CA125值及不良反应。入组患者共完成670个周期化疗,贝伐珠单抗使用次数为183次,中位次数为6次。患者目前的生存期为8-16个月。观察PT方案化疗组50例患者化疗后的近期疗效为:CR:3例(6%),PR:27例(54%),SD:12例(24%),PD:8例(16%),ORR:(60.0%),DCR:(84.0%)。PT化疗+Bev组45例患者的近期疗效为:CR:7例(15.6%),PR:28例(62.2%),SD:7例(15.6%),PD:3例(6.6%),客观有效率ORR:(77.8%),疾病控制率DCR:(93.3%)。PT+Bev组出现与贝伐珠单抗相关的不良反应为皮疹和蛋白尿,皮疹1例:1/45(1.2%),停药后皮疹消失;蛋白尿2例:2/45(4.4%),未给予特殊治疗2天后复查尿蛋白转阴。未出现血栓栓塞、心衰、胃肠穿孔等严重不良反应。出现了脱发、恶心、呕吐、食欲减退、全身乏困、骨髓抑制及肝脏毒性等化疗常见的不良反应,上述症状经过对症治疗后缓解或消失,患者可安全完成治疗。对PT组和PT+Bev组患者的血清学CA125均值进行连续10次检测,并进行统计学分析比较,结果显示:PT+Bev组的卵巢上皮性癌患者血清学CA125的均值变化明显。2.VEGF和MVD分别在正常卵巢组、早期手术组、PT组、及PT+Bev组卵巢组织石蜡切片中的表达情况比较:VEGF在正常卵巢组、早期手术组、PT化疗组和PT+Bev组的阳性表达率分别为:45%、92.9%、69.6%和41.9%。卵巢癌组织中的VEGF的表达水平明显高于其在正常卵巢组织中的表达(c2=13.5,p<0.05)。早期手术组、PT组和PT+Bev组的MVD值分别为51.2±2.08条、34.5±0.85条、16.67±0.93条。入组的卵巢上皮性癌组织中VEGF和MVD表达的相关性分析:VEGF的表达和MVD值呈正相关关系。从临床病理学特征看:VEGF表达和MVD值随肿瘤组织学分级的增高而减低。3.CCK-8及流式细胞仪检测结果:贝伐珠单抗联合顺铂对SKOV3细胞的增殖有显著抑制作用(P<0.05),贝伐珠单抗联合顺铂用药的抑制率均大于各单独用药组。流式细胞仪的检测结果:贝伐珠单抗联合顺铂用药组对SKOV3细胞的促凋亡作用要高于顺铂的单独作用,贝伐珠单抗对SKOV3细胞无促凋亡作用。三组药物对SKOV3细胞增殖的抑制作用随药物浓度的增加和作用时间的延长而增强。贝伐珠单抗、顺铂和贝伐珠单抗联合顺铂这三组药物对SKOV3细胞的增殖抑制率表现出一定的浓度和时间依赖性。同时,计算贝伐珠单抗和顺铂两药的相互作用系数CDI:CDI<1,表明贝伐珠单抗和顺铂两药之间为协同作用,我们推论贝伐珠单抗对顺铂作用SKOV3细胞可能有一定的增敏作用,贝伐珠单抗联合顺铂是否可以降低顺铂的使用剂量,减少顺铂使用后的毒副反应,延长化疗药物的作用时间。结论:1.化疗联合贝伐珠单抗靶向治疗卵巢上皮性癌近期临床治疗效果良好,除了出现化疗常见的不良反应外,未出现恶性高血压、血栓、胃肠道穿孔等严重的并发症。为患者的手术治疗创造了良好条件。化疗联合贝伐珠单抗靶向治疗对卵巢上皮性癌患者血清学CA125均值的下降有很好的促进作用。2.卵巢上皮性癌组织中VEGF表达水平明显高于正常卵巢组织中VEGF的表达。PT化疗联合贝伐珠单抗靶向治疗后VEGF蛋白的表达水平下降,卵巢上皮性癌组织中MVD值明显高于正常卵巢组织中的MVD值。贝伐珠单抗靶向治疗后MVD值下降明显。卵巢上皮性癌组织中VEGF和MVD的表达随肿瘤组织学分级的增高而减低。卵巢上皮性癌组织中VEGF和MVD表达的相关性分析为:VEGF和MVD二者在卵巢上皮性癌组织中的表达呈正相关关系。3.贝伐珠单抗、顺铂单独用药或二者联合用药均能抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖,且贝伐珠单抗联合顺铂对SKOV3细胞增殖的抑制率要高于二者单独用药,联合用药组对SKOV3细胞有促凋亡作用,贝伐珠单抗和顺铂两药对SKOV3细胞的凋亡作用为协同作用。