速杀型神经性毒剂VX的绿色高效降解一直是军用洗消技术研究的难点和热点之一。传统化学洗消剂对VX具有较好的洗消能力,但存在刺激皮肤、腐蚀受染装备表面、用量大、污染环境等问题,无法实现绿色降解。因此,需要探索具有对VX能够高效降解、对装备低腐蚀、无毒副产物产生和无环境污染等特点的新型洗消组分。磷酸三酯酶（PTE,Phosphotriesterase,EC3.1.8.1）是自然界赋予的天然活性组分,对多种环境污染物具有强大的降解能力。但如果直接利用天然PTE作为VX洗消剂的活性成分,还需要解决PTE可溶性表达量低的天然缺陷,进一步提高其对VX的催化降解活性和催化稳定性。本论文以文献报道的对VX有一定降解活性的两种有机磷水解酶（即来源于鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.strain TCM1）的sb-PTE和来源于微小假单胞菌（Brevundimonas diminuta）的2OB3）为起始酶,通过构建酶的可溶性表达载体,实现了有机磷水解酶的可溶性表达;进一步通过大肠杆菌细胞壁脂多糖合成关基因（msb B）敲除菌株的构建,实现了有机磷水解酶的胞外分泌表达,为突变库筛选过程中酶与底物的充分反应提供基本条件;对高通量筛选系统的芯片通道、筛选准确率以及稳定性等参数进行优化,实现了单细胞微液滴的微流控芯片超高通量筛选,液滴生成通量大于10 kHz,筛选通量大于2 kHz,错误率低于3%;在此基础上,通过易错PCR方法建立了PTE的随机突变库,利用荧光微液滴超高通量筛选方法实现了对突变库的快速筛选,获得对VX降解活性提高PTE良性突变体;对获得的良性突变体以生物被膜活体功能材料的方式进行固定化,进一步提升了酶的催化稳定性和环境耐受能力。课题主要的研究内容如下:1)构建高效表达载体:以sb-PTE和2OB3为目的基因,成功构建了含有麦芽糖促溶标签蛋白的可溶性表达重组质粒,将重组质粒转入E.coli BL21（DE3）中对两种目的基因进行异源表达,亲和色谱对粗酶液进行纯化,每升细菌培养液中分别能获得约10 mg和5 mg较纯净的目标蛋白,实现了酶的异源可溶性表达。研究了MBP-sb-PTE和MBP-2OB3对神经性毒剂模拟剂甲基对硫磷和神经性毒剂VX的初始降解活性,发现两种酶的活性中心为Zn2+时活性最高,但对含P-O键和P-S键的有机磷化合物表现出降解偏好性差异。MBP-sb-PTE对VX显示出较好的催化降解活性,其降解VX的方式是断裂P-S键,产生毒性远低于VX的巯基化合物。以甲基对硫磷为底物时,MBP-2OB3显示出较好的催化降解活性,其最适反应温度和pH分别为40℃和pH8.5,对高温、较强酸碱条件、高浓度DMSO和盐溶液耐受能力较弱。2)构建胞外分泌表达菌株:采用Red同源重组技术,成功敲除了表达菌株E.coli BL21（DE3）细胞壁脂多糖合成相关基因msb B,构建了细胞膜渗漏突变菌株E.coli BL21（DE3）K-msb B,并将MBP-sb-PTE和MBP-2OB3的重组质粒转入敲除菌株进行表达。生长曲线结果表明,该基因的缺失对该菌株的生长状态几乎没有影响;Western Blot分析和胞外酶活性检测结果表明,该表达体系可以实现两种酶的胞外分泌表达,且分泌表达的酶保留了酶的催化活性。3)建立基于荧光分选的单液滴微流控芯片超高通量分选方法:分别制作了微液滴生成、观察和分选芯片,荧光染料微液滴的生成通量可达10 kHz,液滴生成稳定,液滴融合率低,未出现破碎现象;两种染料液滴混合液的分选错误率仅为2.487%和2.741%。根据液滴内细菌数量分布符合泊松分布的特征,调整细菌浓度获得了单细菌液滴。观察细菌液滴随着培养时间的生长情况发现,细菌细胞明显增殖并可以正常表达GFP蛋白。以GFP蛋白产生的荧光作为分选信号,实现了含细菌液滴与不含细菌空液滴的分离,分选精确度高,效果稳定。4)基于微流控芯片超高通量筛选的PTE定向进化:通过易错PCR随机突变库建立方法获得了大量突变体,采用微流控芯片超高通量分选与96孔板筛选相结合的方法对所获得的突变库进行了筛选。通过两轮微流控芯片超高通量分选获得的突变体经96孔板复筛后,得到良性突变体的概率超过96%。其中,突变体G314D不仅酶活力较高,并且其耐酸和耐高温能力也有不同程度提高。5)构建良性突变体生物被膜材料:构建了环境耐受性能优越的G314D生物被膜,并对其进行物理性能表征。相对于未经固定化的酶,生物被膜在相对高温、高pH、高盐或高有机溶剂体系中,均能保持80%以上活性,表现出更稳定的酶催化活性,有望大大提升生物酶材料的实用性能。该生物被膜材料可多次使用,具有很好的循环催化能力,经过5轮循环催化,活性仍保持90%以上。