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cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一,它是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因,并直接用于该基因的表达。经典cDNA文库存在克隆的片段短等缺点,而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息,从而能够克隆出目的cDNA的全长序列。本研究以人胎盘组织为材料,用TRIzol试剂提取总RNA,以LD- PCR(long-distance PCR)为基础构建cDNA文库,并对构建文库的质量作了鉴定,克隆出人生长激素cDNA的全长序列,为重组人生长激素的研究提供了理论依据和技术基础。获得如下具体结果。1.称取100mg组织放入预冷的匀浆器中,加入1ml变性剂TRIzol,进行匀浆;离心后,在上清中加入200μl氯仿抽提,吸取上清,加入等体积的异丙醇沉淀; RNase-free水重溶沉淀,加入1/10体积的乙酸钠和等体积氯仿反复抽提,直到界面间无泡沫状的蛋白质为止;加入等体积的预冷的异丙醇沉淀,用预冷70%的乙醇漂洗两次;用30-50μlDEPC处理ddH2O溶解沉淀,提取总RNA,-70℃保存。2.以TRIzol试剂提取的总RNA为模板,以F1、R2、F3、R4为两对特异性引物,经反转录酶和聚合酶作用得到ds-cDNA。双链cDNA经SfiⅠ酶切, T4 DNA连接酶连接到经相同酶切的JG45质粒载体后转化感受态细胞JM109,构建人胎盘组织cDNA文库。3.通过对文库的容量、重组率以及多样性进行分析,所构建的cDNA文库容量约为7.01×l05个/μgds-cDNA,重组率为96%,对随机提取的100个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得80个不同的cDNA序列,且未见重复序列。结果表明,本方法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单、高效等特点,文库质量符合要求,可用于大规模的基因分析。4.从人胎盘组织分离提取总RNA,利用RT-PCR(一步法)方法和从构建的cDNA文库中提取菌落质粒DNA为模板进行质粒PCR,均扩增出人生长激素全长cDNA序列,进行比较,发现其序列完全一致。