急性肝功能衰竭是一类死亡率极高的综合征候群。近年来,生物人工肝(bioartificial liver, BAL)支持系统已成为延长急性肝功能衰竭患者生命,并向肝移植手术过渡的一种替代性治疗手段。其中,肝细胞是BAL的生物核心材料,BAL对肝功能衰竭患者的支持作用有赖于所用肝细胞的生物学特性。因此,如何获得更接近正常人肝细胞功能、对人体无害且足够数量的肝细胞历来成为BAL领域的研究热点。原代肝细胞是一种高分化细胞,正常生理状态下处于静止期,很难分化增殖,一旦失去体内生存微环境,在体外传统培养过程中极易丧失其结构特征和分化再生能力,呈“去分化”状态。近年来,许多研究证实肝细胞和非肝实质细胞在体外共培养可通过异质细胞间的相互作用充分模拟肝细胞在体内的生存环境,形成缝隙连接、胆管样结构,故可有效延长肝细胞的生存时间,促进肝细胞增殖分化,并保持肝细胞特有的生物学功能。因此,共培养是肝细胞大规模、高活性培养并最终应用于BAL的理想培养方式。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCS)是一类具有自我复制和多向分化潜能的干细胞,既容易分离又易于在体外扩增,以其分泌多种可溶性细胞因子和表达内生性细胞外基质的特点,在骨髓中为造血干细胞的生长、增殖、迁移和分化提供必要的微环境。有鉴于此,骨髓MSCS与肝细胞共培养可能成为BAL的理想细胞来源。本课题旨在明确骨髓MSCS与肝细胞共培养对肝细胞的作用和规律,揭示共培养中肝细胞增殖与凋亡的分子生物学机制,确定共培养体系中肝细胞增殖与凋亡的关键分子靶点,既解决了BAL中肝细胞大规模、高活性和高功能培养问题、为BAL提供最适细胞来源,又为进一步将分子靶向研究应用到肝细胞大规模培养中奠定坚实的理论基础。另外,急性肝功能衰竭的预后取决于并存在患者血浆/血清中的循环再生抑制因子与肝细胞再生因子之间的竞争与对抗,骨髓MSCS与肝细胞共培养体系能否耐受肝功能衰竭血浆/血清的细胞毒性作用、有效发挥肝细胞支持功能是影响BAL效能的关键问题。第一部分肝细胞与骨髓MSCS最适共培养体系的建立和规律研究目的:建立猪肝细胞与骨髓MSCS体外最适共培养体系,为BAL的构建提供理想细胞来源。方法:自中华实验猪(n=3)髂前上棘抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代,流式细胞仪分别鉴定各代CD29、CD44、CD45和CD90比例。原位两步胶原酶法分离猪肝细胞,台盼兰拒染实验判断肝细胞活率,并采用抗白蛋白和CK18免疫细胞化学染色法鉴定肝细胞纯度。将肝细胞与MSCS分别按照1:1、2:1、5:1和10:1等不同比例随机混合培养,并设立肝细胞与MSCS单纯培养组为对照组。观察各组肝细胞形态和功能变化及随时间变化规律。结果:第3代骨髓MSCS纯度>90%,新鲜分离的肝细胞活率>95%,纯度>99%。倒置显微镜观察发现共培养组肝细胞迅速粘附于MSCS表面,并呈球形聚集生长。电镜观察提示共培养组有大量细胞外基质存在,且肝细胞内超微结构与正常肝细胞接近,异质细胞间可见细胞连接形成。共聚焦显微镜进一步提示异质细胞间形成三维分层生长。活细胞工作站记录MSCS高迁移性,且与肝细胞聚集生长相关。共培养组肝细胞糖原染色明显强于对照组,抗白蛋白免疫细胞化学染色示实验组肝细胞内白蛋白水平较对照组显著增高。Dead/Live荧光染色见共培养组肝细胞活性较对照组明显改善。肝细胞/MSCS共培养2:1组的白蛋白分泌水平和尿素合成能力为各组中最佳,自第1d共培养起显著高于各组(P<0.05),并在第2d达到高峰,且随后的下降趋势较缓慢。流式细胞仪分选出共培养组肝细胞经Western Blotting检测提示2:1组肝细胞内白蛋白和细胞色素P4503A1合成水平均较其余各组显著增高(P<0.05)。细胞周期检测提示共培养组肝细胞分布于G2-S期的比例较对照组显著增加(P<0.05)。结论:猪肝细胞与骨髓MSC体外共培养可维持肝细胞形态与功能,猪肝细胞与MSC按2:1比例接种培养至第2d可最大程度维持肝细胞功能,为构建功能性BAL提供高效细胞材料。第二部分骨髓MSCS参与肝细胞培养的作用机制研究目的:探索骨髓MSCS来源的细胞外基质和可溶性细胞因子在最适共培养体系中的作用。方法:自中华实验猪(n=3)髂前上棘抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代;原位两步胶原酶法分离猪肝细胞后与MSCS按照2:1比例随机混合培养至第2d,免疫细胞化学染色观察纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I、III、V型胶原表达水平和胞内外分布情况。合成纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I和V型胶原SiRNA特异性片段分别转染MSCS后再与肝细胞共培养,观察肝细胞特异性功能变化水平。使用Millicell悬挂式小室将猪肝细胞与MSCS按照2:1比例隔离培养,观察非直接接触共培养体系中肝细胞特异性功能变化,检测培养液上清中TNF-α、IL-6和TGF-α水平。抗IL-6中和抗体孵育后的MSCS与肝细胞建立上述共培养体系,检测肝细胞特异性功能变化水平。结果:免疫细胞化学染色提示单纯培养的肝细胞内表达除纤维连接蛋白以外所有细胞外基质,而MSCS胞内外均不表达III型胶原。共培养组肝细胞与MSCS之间分布大量细胞外基质网络,由纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I型和V型胶原组成。Western Blotting检测提示RNAi片段转染MSCS后纤维连接蛋白、层粘连蛋白和I型胶原表达干扰效率超过85%,V型胶原超过50%。各干扰组白蛋白分泌水平和尿素合成水平均较对照组显著下降(P<0.05)。非直接接触共培养组白蛋白和尿素浓度与肝细胞培养组相比较显著升高(P<0.05)。肝细胞组、共培养组、MSCS组上清液中均未检测到TNF-α。TGF-α水平在肝细胞组与共培养组之间没有统计学差异(P>0.05)。共培养组和MSCS组IL-6水平较肝细胞组显著增高(P<0.05),两组之间未见统计学差异(P>0.05)。IL-6中和抗体实验后白蛋白分泌和尿素合成水平较对照组显著降低(P<0.05)。结论:骨髓MSCS通过分泌纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I和V型胶原,以及IL-6共同提高原代肝细胞特异性功能,为组织工程、细胞生物学和BAL的研究提供新手段。第三部分骨髓MSCS共培养下的肝细胞蛋白质组学研究目的:比较骨髓MSCS与原代肝细胞构建最适共培养体系前后肝细胞内蛋白质表达谱的差异,并对明确的蛋白质进行功能分析,在蛋白质水平上阐明骨髓MSCS共培养下的原代肝细胞功能改善的机制。方法:自中华实验猪(n=3)髂前上棘抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代,与原位两步胶原酶法分离得到的猪肝细胞建立最适共培养体系。流式细胞仪分选CD44-CD45-细胞群,并设立肝细胞单纯培养组作为对照,每组重复3次。将提取的蛋白样品采用固相pH梯度双向凝胶电泳进行分离,使用ImageMaster 2D Elite软件对图像进行匹配和差异分析,识别两组间表达差异的蛋白质点,将部分差异蛋白点进行胶内原位切割、酶解后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异表达的蛋白质,获得肽质指纹谱。通过生物信息学查询鉴定蛋白质并将差异蛋白质分子归类相应生物学事件。Western印迹技术验证部分蛋白质在肝细胞单纯组与共培养组肝细胞之间的表达差异。结果:流式细胞仪可将共培养细胞分选为CD44-CD45-(肝细胞)、CD44+CD45-(MSCS)两群。经双向凝胶电泳成功建立肝细胞蛋白质二维电泳图谱,图像分辨率高,重复性好。两组间差异表达量≥3倍的蛋白质点共40个,其中表达上调的19个。经质谱鉴定出34个蛋白点,Western Blotting检测证实CFTR、IL-6、HMG-1变化水平与蛋白质组结果基本一致。这些差异蛋白的分子功能主要与肝脏代谢功能、细胞周期调节、细胞增殖与凋亡、免疫调节等相关。结论:采用比较蛋白质组学的方法可以发现大量与骨髓MSCS共培养下的原代肝细胞内差异表达的蛋白质,这些功能蛋白的差异表达可能与MSCS和原代肝细胞体外共培养下肝细胞特异性功能改善、细胞生存时间延长、免疫调节密切相关,为进一步优化肝细胞功能提供了靶点。第四部分骨髓MSCS诱导肝细胞耐受肝功能衰竭血清的实验研究目的:明确与骨髓MSCS共培养的肝细胞可耐受慢加急性肝功能衰竭患者血清的细胞毒性,以及共培养细胞对肝衰血清的肝功能支持作用。方法:患者知情同意前提下收集慢性乙型肝炎慢加急性肝功能衰竭患者血清(n=18)及正常志愿者血清(n=18)。建立猪肝细胞与骨髓MSCS最适共培养体系。实验分为4组:肝衰竭血清单纯肝细胞培养组(Hep-F)、肝衰竭血清共培养组(Co-F)、正常人血清单纯肝细胞培养组(Hep-N)和正常人血清共培养组(Co-N)。血清浓度依次为10%、20%、40%、60%、80%和100%。培养24h后收集上清液检测白蛋白水平和肝细胞周期确定最适肝衰竭血清浓度。观察细胞生长状态、超微结构及细胞活力。分别检测60%浓度血清培养组SOD、LDH、GLN和CHE水平。更换为含10%胎牛血清的完全培养基继续培养24h,收集肝衰竭血清单纯肝细胞培养组(Hep-FB)、肝衰竭血清共培养组(Co-FB)、正常人血清单纯肝细胞培养组(Hep-NB)和正常人血清共培养组(Co-NB)上清液,重复检测SOD、LDH、GLN和CHE水平。结果:骨髓MSCS共培养后的肝细胞在60%浓度的肝衰竭血清中肝细胞贴壁数量最多,呈岛状聚集生长。肝细胞表达白蛋白水平最佳(P<0.05),G2-S期细胞比例升至32.08%,细胞内超微结构接近正常,细胞活力较对照组明显改善。Hep-F组SOD、GLN、CHE活性显著下降(P<0.05),而LDH显著升高(P<0.05);Co-F组SOD、GLN和LDH水平与Co-N组之间差异无统计学意义(P>0.05),仅CHE活性有所下降(P<0.05),但与Hep-F组比较有显著性提高(P<0.05)。Hep-NB、Hep-FB、Co-NB与Co-FB之间SOD活性的差异无统计学意义(P>0.05);Co-FB组LDH、GLN、CHE活性较Hep-F组有显著性改善(P<0.05)。结论:与骨髓MSCS共培养的肝细胞可耐受中高浓度慢加急性肝功能衰竭血清的细胞毒性,有效维持肝细胞功能的支持作用。