[背景与目的]：深静脉血栓是心血管系统的常发疾病,也是骨科住院患者常见的并发症之一。在血栓形成的三要素中,血管壁改变是血栓形成的关键要素。静脉血管壁包括内膜、中膜和外膜,其中,直接与血液接触的内膜由静脉内皮细胞层包绕形成,它可以稳定血管通透性,维持正常的内皮屏障功能,当内皮屏障功能受到损害时,储存于内皮下层的组织因子(Tissue factor,TF)异常释放入血,启动外源性凝血途径,促血栓形成。因此阐明深静脉血栓形成时静脉内皮细胞通透性改变及调控机制有非常重要的实用意义。研究表明细胞骨架结构及紧密连接(tight junction, TJ)是内皮屏障结构和功能的主要基础。LPS作为细菌内毒素可以引起机体严重的脓毒血症,LPS在体内微循环发生促使纤维蛋白异常增多的生物学炎性作用,进而导致弥散内血管凝血(DIC), DIC的本质就是微小毛细血管被嗜酸性同质性纤维蛋白堵塞,形成“透明血栓”。LPS更主要的生物学功能作用体现在对细胞膜稳定性和完整性的影响。有研究发现LPS导致的血管内膜炎症反应会破坏内皮细胞膜的完整性,在血小板减少小鼠模型中比正常小鼠出现更多的出血反应,炎症反应引起的血管内膜稳定性和完整性损害是血小板减少症出血的核心诱因,LPS介导的炎症反应主要依靠血小板ITAM通路而不是经典的GPCR通路来调控血管内膜的稳定性。DVT也是与血管内膜稳定性关系密切的疾病,根据前述研究,我们推断LPS引起的静脉内膜改变可能参与DVT病理生理过程。静息状态下,静脉内皮细胞层是一层排列整齐的功能屏障层,细胞之间的连接秩序井然,有效防止了储存于内皮下层的凝血因子TF释放入血。静脉内皮细胞主要通过两种骨架蛋白--肌球蛋白和肌动蛋白来维持相互之间的张力及细胞膜形态,炎症反应发生之后,炎症反应导致的静脉内皮细胞分泌粘附分子如E-selectin、ICAM-1发生功能改变,内皮细胞肌球蛋白和肌动蛋白构象发生变化与重排内皮细胞膜表面发生“皱褶”,出现细胞物理间隙,进而引起内皮屏障功能损害。血管内皮屏障功能得以维持还依靠于一个重要结构基础即细胞间连接,血管内外的小分子物质通过胞旁途径转运时,主要通过细胞紧密连接的方式进行调节,紧密连接的物理结构由数种跨膜蛋白和细胞内胞质蛋白组成,其中最具决定性生物学作用的是细胞间紧密连接蛋白ZO-1。LPS刺激所导致的血管炎症反应如何改变细胞间连接蛋白的表达,从而影响内皮细胞通透性?考虑到炎症反应-深静脉血栓形成关系研究中存在一些不确定因素,以及进一步探索LPS引发静脉内皮细胞膜形态与通透性改变在深静脉血栓形成所起的作用,本研究重点探讨LPS刺激细胞粘附分子分泌、炎性粘附增加、细胞形态及内皮通透性的改变、促进血栓形成的分子机制。[方法]：(1)建立大鼠下腔静脉血栓模型,观察下腔静脉静脉狭窄后2小时-21天的下腔静脉血栓形成情况,取材称量比较各个时间点血栓的质量及长度并进行病理检测,得出大鼠下腔静脉血栓发生、发展、消退的时间规律；采集血浆标本检测细胞因子IL-6、CRP、TLR、TNF-α的蛋白表达变化；静脉壁qPCR检测E-selectin及细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的mRNA表达变化情况。采用线性相关分析(Linear regression analysis, Pearson)方法,对上述细胞因子与深静脉血栓长度、质量的线性关系进行拟合分析。(2)LPS腹腔注射加下腔静脉狭窄法制造内毒素炎症下腔静脉血栓模型,另设对照组,造模后24h取材称量下腔静脉壁+血栓质量、长度,用10%中性甲醛液将整段血栓+静脉壁固定(en bloc技术),脱水石蜡包埋,运用静脉壁形态定量测定(Vein Wall Morphometrics)分析技术,根据高倍镜下不同细胞形态,统计中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、总炎性细胞数目；用Masson、vG特殊染色方法,半定量观察静脉壁与血栓的纤维蛋白含量变化。免疫组化SP法测定E-selectin、P-selectin、ICAM-1表达变化,并测定TF含量。(3)设定不同的LPS终浓度(10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、 400ng/ml)和不同的LPS刺激时间(3h、6h、12h、24h、48h), qPCR法半定量检测不同刺激条件下的E-selectin、ICAM-1mRNA转录水平。选定LPS的刺激条件：200ng/ml,24h,设立空白对照组和LPS刺激组,分别用免疫组化荧光染色来检测E-selectin、ICAM-1表达变化；采用Transwell,分别检测THP-1细胞与HUVECs的粘附情况和迁移情况,了解LPS对内皮细胞和炎性细胞的粘附、迁移能力影响。(4)将HUVECs接种于96孔细胞培养板,37。C、5%C02培养箱孵育培养24h。更换不含青-链双抗的新鲜培养基,加入Y-27632 (Sigma-Aldrich),其终浓度为10UM,37。C、5%C02培养箱孵育培养30min(此步过程为信号通路抑制剂预处理)。更换不含青-链双抗的新鲜培养基,加入LPS (Sigma-Aldrich),终浓度200ng/mL,另设一组不加LPS作为空白对照。两种处理因素结合共孵育24h。免疫荧光法检测各组F-actin的变化；蛋白印迹法检测各组紧密连接蛋白-I表达情况。[结果]：(1)狭窄法造模后至各个取材的时间点大鼠存活率均为100%,大鼠下腔静脉血栓稳定形成。细胞因子IL-6、CRP、TLR、TNF-α在造模后有不同程度的升高变化。静脉壁qPCR检测E-selectin及细胞间粘附分子-1 (ICAM-1)的mRNA表达变化发现,在造模后6h, E-selectin及ICAM-1均有显著表达变化,其mRNA表达上升,并维持较高变化水平变化直至21d。(2)LPS在注射后24小时血药浓度达峰值,Masson和vG染色显示肝肺发生严重的纤维化和炎症反应,证实LPS对大鼠机体的炎症影响。LPS注射后IVC血栓的质量和血栓的质量长度比都发生了显著升高(P<0.05)。静脉壁(血栓)切片染色结果证实注射LPS后血栓密度增加,Masson和vG染色结果发现LPS促使血栓中纤维蛋白含量增加。静脉壁形态测定发现注射LPS后炎性细胞总数增加,其中,单核细胞增加最显著(P<0.05)。免疫组化SP法测定发现在LPS刺激后,E-selectin粘附分子的表达含量增加(P<0.05),P-selectin表达变化不明显,TF的含量增加(P<0.05),TF的增加程度与纤维蛋白呈线性相关。(3)LPS刺激HUVECs可以使得E-selectin及ICAM-1的mRNA转录水平增加,差异具有统计学意义,表达水平的改变与LPS刺激时间和刺激浓度均呈依赖关系。免疫荧光检测结果发现,在静息状态下HUVECs不表达E-selectin和ICAM-1,而在LPS刺激状态下,E-selectin和ICAM-1在HUVECs胞浆内均有强表达,说明LPS增加了HUVECs胞浆内E-selectin、ICAM-1的蛋白表达水平。在LPS刺激情况下,HUVECs与THP-1的粘附率较LPS空缺情况下要高(53.2±4.8%vs.17.1±6.5%,P<0.05); LPS刺激后,THP-1细胞的迁移率为50.2±6.3%,高于空白对照组(17.8±4.6%)。(4)激光共聚焦显微镜下显示,空白对照组HUVECs内的F-actin分布于细胞膜周边,呈均匀分布；LPS刺激组F-actin细胞膜周边的分布明显减少,而细胞胞浆中出现应力纤维增多；Y-27632预处理组细胞内应力纤维较LPS刺激组少,但较空白对照组仍有一定程度增加。显示LPS刺激影响HUVECs细胞骨架改变与重排。一组用小分子Y-27632加入HUVECs预处理30分钟,再加入LPS,另一组单加LPS,刺激24h后用蛋白印迹法检测细胞间紧密连接蛋白ZO-1发现：Y-27632预处理使得对照LPS刺激HUVECs后细胞间紧密连接蛋白-1变化不显著,说明RhoA/ROCK信号通路参与调节LPS介导的细胞通透性改变。[结论]：1.下腔静脉狭窄法(stenosis)可成功建立动物血栓模型,下腔静脉狭窄法建模成功基于大鼠(啮齿类动物)独特的脉管系统。2.动物模型血栓病变分期可分为起始期、稳定期和消退期,在三个病变分期中均有炎症因素参与。3.LPS促进了动物模型成栓效应。LPS增强粘附分子与TF在DVT表达,此效应与内皮屏障受损有关。4.LPS在一定的刺激浓度和刺激时间作用下刺激导致HUVECs功能活化,RhoA/ROCK信号通路被抑制影响了F-actin的表达分布,抑制RhoA/ROCK信号通路可以使得LPS对HUVECs细胞骨架重排的刺激作用发生逆转。5.LPS改变内皮细胞膜形态及通透性的分子机制：LPS通过激活RhoA/ROCK信号通路,下调细胞间紧密连接蛋白ZO-1和细胞F-actin蛋白表达,细胞膜微丝增多,增加细胞通透性。