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番木瓜花叶病毒(Papaya mosaic virus, PaMV)是马铃薯X病毒属(Potexvirus)的植物病毒,是番木瓜种植的主要病害之一。本研究提取海南果园番木瓜病叶样品总RNA,反转录得到cDNA第一链,基于已报道的番木瓜花叶病毒全长基因组序列(GenBank登录号：NC001748),设计引物,PCR扩增PaMV-CP基因序列,通过测序和序列比对分析确定发病植物感染了PaMV。再通过RT-PCR扩增PaMV-HN全长cDNA序列(GenBank登录号：JX524226),克隆及测序结果表明,所获得的病毒cDNA全长为6656bp(不包括3’端ployA),包括5个开放阅读框(ORF),5’端和3’端分别有99bp和119bp的非编码序列(UTR)。与国外报道的PaMV分离物全长核苷酸序列的相似性达99.6%。本研究成功构建了2种PaMV-HN全长cDNA侵染性克隆。一种为农杆菌介导的侵染性克隆PaMV-HN-3,一种为体外转录侵染性克隆PaMV-HN-4。PaMV-HN-3的构建通过特异引物PCR在PaMV-HN全长cDNA3’端引入27个碱基的ployA,然后利用中间载体在两端连入CaMV35S启动子和NOS终止子。PaMV-HN-4的构建是通过In-fusion法将PaMV-HN全长cDNA连入T-easy载体使之置于T7启动子下游。2种侵染性克隆分别通过农杆菌渗透法和摩擦接种法侵染番木瓜幼苗,侵染效率分别为63.3%和33.3%。农杆菌介导的PaMV-HN全长cDNA侵染性克隆发病较早,侵染效率更高,比体外转录法更适合番木瓜侵染性克隆的研究。本研究还将PaMV-HN全长cDNA成功改造为病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing, VIGS)载体。利用长片段套叠PCR (OE-LD PCR)技术在病毒基因组中引入了一个额外的亚基因启动子,并将外源基因ccdB(该基因为细菌致死基因)插入在其下游,ccdB基因可以通过OZ-LIC法方便快速地替换为目的基因来进行大规模沉默载体的构建。本研究利用OZ-LIC法将ccdB基因替换为番木瓜八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因片段,构建PaMV-HN VIGS载体PaMV-VIGS-3。通过农杆菌介导注射接种番木瓜幼苗,接种2周后出现PDS基因沉默的光漂白现象,接种6周后出现系统性沉默现象,系统性沉默效率为36.7%。29.4%的沉默表型未发生系统性沉默,大部分新生叶片的光漂白现象在接种8周后开始减弱。本研究首次在海南发现并成功克隆PaMV病毒cDNA全长,为PaMV分子水平的研究和PaMV病害防治的策略奠定了基础。PaMV VIGS载体的成功构建和OZ-LIC法的利用,适合大规模进行番木瓜基因组基因的功能研究,对建立一个快速高通量番木瓜基因功能鉴定平台具有很大意义。