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研究背景脑缺血在全球范围内是导致成人死亡和残疾的主要原因之一,严重威胁人类的健康。脑缺血会降低脑部微环境中的氧气浓度,由于神经细胞对氧气浓度非常敏感,脑缺血对神经系统损伤最为严重,易造成脑性瘫痪、癫痫等疾病发生。目前尚无针对脑缺血的特效治疗手段,临床治疗主要以溶栓和神经保护为主。溶栓法治疗在临床应用的效果显著,但治疗时间窗短,无法广泛运用,因此急需能满足临床需要的神经保护剂。本团队研发的异甜菊醇钠（STVNa）,已在小鼠身上被证实有保护神经细胞免受脑缺血损伤的作用,但其具体作用机制尚不明确。因此,本文使用小鼠神经母瘤细胞株N2a细胞和C57BL/6小鼠,研究STVNa对脑缺血损伤的保护作用及机制。脑缺血后,会激活一系列促炎和促凋亡的信号通路,分泌炎症因子和凋亡因子,进一步加剧脑缺血损伤。核转录因子（Nuclear Factor kappa B,NF-κB）亚基p65在脑缺血后被磷酸化激活,转移到细胞核内,调节促炎介质基因的转录。同时,脑缺血后也会上调一种常见的异源二聚体蛋白复合物缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor 1,HIF-1）以应对缺氧。HIF-1的亚基HIF-1α调节编码参与红细胞生成,细胞增殖,和能量代谢分子的基因表达,并与神经元存活的缺血调节密切相关。HIF-1α的上游通路众多,但最主要的调节通路是MAPKs通路和PI3k（phosphatidylinositol-3 kinase）-Akt（protein kinase B）通路。MAPKs被激活后会过度合成促炎细胞因子,随后触发炎症反应并形成凋亡级联。而PI3K和下游效应子Akt属于信号转导酶的保守家族,参与调节细胞活化,炎症反应和细胞凋亡。PI3K和下游效应子Akt属于信号转导酶的保守家族,参与调节细胞活化,炎症反应和细胞凋亡。目的探索STVNa是否通过抑制MAPKs、NF-κB的磷酸化以及上调Akt/mTOR/HIF-1,发挥神经保护作用的分子机制。方法1.通过检测细胞LDH、细胞活力实验和流式细胞仪确定CoCl2化学缺氧的最佳浓度以及STVNa的最佳给药剂量。2.用Fluo-4AM和ROS分别检测STVNa对化学缺氧的N2a细胞Ca2+和活性氧浓度的影响。并用RT-PCR实验技术检测TNF-α、iL-6、iL-1β、iNOS的mRNA水平的变化情况,Western Blot检测Bcl2/Bax蛋白的比值大小以及Caspase3的变化情况。3.利用RT-PCR和Western Blot等实验手段检测STVNa预处理对化学缺氧损伤后Akt/HIF-1α和MAPK以及NF-κB通路上下游基因的mRNA和蛋白变化水平的影响。4.同时利用大脑中动脉栓塞模型构建体内脑缺血损伤验证STVNa对MAPK、NF-κB以及Akt/HIF-1α信号通路的影响。结果1.使用化学药物CoCl2处理N2a细胞进行体外模拟脑缺血损伤,确定了CoCl2最佳处理浓度为300μM,STVNa的最佳治疗剂量为20μM。2.CoCl2诱导的缺氧条件下,STVNa预处理显著缓解细胞活力减弱,乳酸脱氢酶释放和细胞凋亡。同时,STVNa预处理显著减弱了因缺氧损伤造成的细胞内Ca2+浓度和活性氧生成的上调,并抑制了细胞的线粒体去极化。且STVNa会降低化学缺氧引起的Bcl2/Bax蛋白比值增大以及Caspase3蛋白浓度的升高。此外,STVNa预处理显著下调炎症和凋亡因子的表达,抑制NF-κB和MAPK信号激活。3.体外实验中,STVNa激活了PI3K/Akt通路,上调了p-Akt、p-mTOR蛋白,从而促进HIF-1α及其下游基因表达。进一步增加HIF-1α的蛋白,从而促进其下游通路VEGF、Glut-1等基因的转录。4.体内实验中,NF-κB和MAPK以及PI3K/AKT/mTOR相关的mRNA和蛋白变化情况与体外N2a细胞化学缺氧24h后的变化情况一致。结论1.STVNa通过抑制CoCl2引起的MAPK和NF-κB通路的激活从而抑制细胞炎症和凋亡。2.STVNa通过上调Akt/mTOR/HIF-1α信号通路,发挥神经保护作用。