副溶血性弧菌耐药株的生物学特性与耐药基因突变分析

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副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP),是一种革兰氏阴性嗜盐菌,是引起人体出现食源性疾病的主要微生物因素之一。本研究采用微量肉汤稀释法测定了9种常见抗生素对21株副溶血性弧菌分离株和2株标准菌株的MIC值,比较了耐药水平不同的副溶血性弧菌在生物学特性和抗逆能力方面的差异,通过全基因组比较发掘了相关耐药基因的非同义突变,旨在为副溶血性弧菌耐药菌的监测与防控提供数据支撑,以及从基因突变的角度初步解析了副溶血性弧菌的耐药机制。主要研究内容和结果如下:(1)药敏实验通过药敏实验测定了9种常见抗生素对21株副溶血性弧菌分离株和2株标准菌株的MIC值,并根据菌株的耐药水平将其分为2重耐药株与3重耐药株。药敏实验结果显示23株副溶血性弧菌对9种抗生素的耐药率从高到低依次为:氯霉素(100%)、氨苄西林(100%)、阿莫西林(100%)、头孢呋辛(21.7%)、萘啶酸(13%)、环丙沙星(8.6%)、卡那霉素(4.3%)、头孢唑林(4.3%)、诺氟沙星(0%)。在四株3重耐药株VP41、469、H128、H256中,H256多重耐药最严重,耐药谱涉及酰胺醇类(氯霉素)、β-内酰胺类(氨苄西林、阿莫西林、头孢唑林、头孢呋辛)、喹诺酮类(萘啶酸、环丙沙星)等三大类7种抗生素。(2)生物学特性与抗逆能力分析以2重耐药株ATCC17802、F7、VP27和3重耐药株H256、VP41作为实验菌株,测定了实验菌株的生长曲线、泳动能力、生物膜形成能力等生物学特性以及对高渗透压环境、强氧化环境、酸性环境的抗逆能力。实验结果显示,在生长过程中,3重耐药株的停滞期较2重耐药株延长,实验菌株可能存在适应性代价的现象。实验菌株泳动能力的强弱顺序为VP27>F7>ATCC17802>VP41>H256,3重耐药株的泳动能力均弱于2重耐药株。实验菌株生物膜形成能力的强弱顺序为ATCC17802>VP27>H256>F7>VP41,发现实验菌株生物膜形成能力与耐药水平之间不具有明显的一致性。抗高渗透压环境能力:H256>VP41>VP27>F7>ATCC17802;抗强氧化环境能力:H256>ATCC17802>VP27>VP41>F7;抗酸性环境能力:H256>ATCC17802>F7>VP41>VP27,3重耐药株H256对高渗透压环境、强氧化环境、酸性环境的耐受能力均强于其他实验菌株。(3)耐药基因及突变位点的发掘采用Illumina Hiseq高通量测序,对菌株VP41、VP44、460、469进行了全基因组测序,将序列与NCBI数据库中副溶血性弧菌标准菌株ATCC17802基因组数据进行比较基因组分析,发现受检菌株中共存在13种耐药相关基因(cat B、bla-CARB、gyr A、par C、qnr、str A、str B、vme A、vme B、vme C、vme D、tet R1、tet R2),并发现在不同菌株中4个耐药基因中存在同样的非同义突变位点,包括:cat B基因(第165位脯氨酸突变为丝氨酸、第208位甘氨酸突变为天冬氨酸)、vme A基因(第313位异亮氨酸突变为苏氨酸)、vme C基因(第329位谷氨酸突变为丙氨酸)、vme D基因(第205位天冬氨酸突变为丝氨酸),这些突变可能与副溶血性弧菌分离株耐药性增强相关。
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