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第一章月经血子宫内膜干细胞促进小鼠子宫内膜损伤修复的研究目的:探讨月经血子宫内膜间充质干细胞(MenSCs)修复受损子宫内膜的能力及可能的作用机制,为临床治疗子宫内膜损伤提供理论基础。材料与方法:1、选择健康6-7周ICR小鼠131只,通过电热损伤小鼠右侧子宫内膜,建立小鼠子宫内膜损伤模型。于建立模型后3天,将子宫内膜损伤小鼠随机分为MenSCs移植组(n=75),生理盐水组(n=56),经尾静脉注射干细胞或者生理盐水。2、采用Dil标记MenSCs进行干细胞移植后的体内示踪,分别于移植后3天(MenSCs移植组n=13,生理盐水组n=12),7天(MenSCs移植组n=17,生理盐水组n=16),14天(MenSCs移植组n=13,生理盐水组n=11),通过小动物成像仪观察MenSCs的归巢情况,HE染色检测子宫内膜组织结构,测量子宫内膜厚度;免疫组织化学检测子宫内膜微血管密度(MVD)标志蛋白CD34的表达。3、于移植后7天,将雌雄ICR小鼠与雄性小鼠合笼(MenSCs移植组n=28,生理盐水组n=14),评估MenSCs对小鼠受损子宫内膜生育能力的影响。结果:1、电热可破坏子宫内膜腺体和间质,造成子宫内膜变薄、宫腔狭窄,引起小鼠生育能力下降,可有效建立子宫内膜损伤模型,较好的模拟了人类子宫内膜损伤。2、子宫内膜厚度及微血管密度比较:移植3天后MenSCs移植组和生理盐水组子宫内膜厚度和MVD没有明显差异(厚度:298.26±135.15μm vs 268.46±72.19μm,P=0.414,MVD:0.24±0.04 vs 0.38±0.05,P=0.058),然而移植 7天后MenSCs移植组子宫内膜厚度和MVD明显高于生理盐水组(厚度:252.12±78.58μm vs 137.97±61.56μm,P=0.010,MVD:0.32±0.03 vs 0.96±0.03,P=0.000)。移植14天后两组子宫内膜厚度和微血管密度没有明显差异。3、生育力比较:MenSCs移植组损伤侧小鼠妊娠率为15/28(53.57%),生理盐水组为2/14(14.29%),差异有明显的统计学意义(P=0.014)。经MenSCs治疗后损伤侧平均胚胎数目为3.0357 ± 0.5986,生理盐水组为0.8571 ± 0.661,差异有明显统计学意义(P=0.030)。结论:MenSCs移植有利于子宫内膜损伤后的修复,不仅能够增加子宫内膜厚度,而且能够改善受损子宫内膜的生育能力,其中可能的机制为MenSCs的促血管形成作用,为临床探索子宫内膜损伤和宫腔粘连的治疗方法提供新的方向。第二章月经血子宫内膜间充质干细胞通过AKT和ERK途径促进血管生成的研究目的:探索月经血子宫内膜间充质干细胞(MenSCs)旁分泌作用对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的血管生成作用及其分子机制。材料和方法:MenSC培养24小时或者48小时后收集条件培养基(CM)。通过细胞计数实验-8分析(CCK8),AlexaFluor 488 Annexin/Dead凋亡试验,划痕修复试验和基质胶管血管形成试验观察分析CM或对照组(DMEM/F12)对HUVEC增殖,凋亡,迁移和血管生成的作用;并且通过小鼠基质栓试验体内观察CM对内皮细胞迁移和血管形成的作用。此外通过蛋白电泳分析CM或对照组对HUVECs中的磷酸化和总AKT,P38,JNK,ERK表达水平的影响。此外,应用Q-PCR来确定AKT和ERK的下游与血管生产相关的靶基因转录水平,包括VEGF家族,Ang家族和eNOS。结果:MenSCs-CM能够促进脐静脉内皮细胞的增殖和迁移能力,抑制其凋亡。与对照组相比,Matrigel血管生成实验发现MenSCs-CM处理HUVECs 4个小时后有明显的血管形成;定量分析成环数,血管面积和血管长度发现CM组和对照组之间有明显的统计学差异(P<0.05)。同时Matrigel血管形成试验发现CM组有更多的内皮细胞迁移及小血管形成。同样,体内试验我们观察到MenSCs-CM更能促进内皮细胞迁移和血管形成。此外,我们发现MenSCs-CM可以上调HUVECs中的AKT及ERK磷酸化水平,但对JNK和P38磷酸化水平没有影响。进一步定量PCR分析发现:与对照组相比,HUVECs经MenSCs-CM处理后AKT及ERK下游靶基因eNOS、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2的表达水平明显升高。结论:MenSCs-CM可以提高AKT和ERK的磷酸化,增加与血管生成相关的靶基因,包括VEGF,VEGFR,eNOS的表达,并进一步刺激HUVECs增殖,抑制凋亡,促进HUVEC的迁移和血管生成。总而言之,我们的研究表明MenSCs旁分泌作用能够促进内皮细胞的血管生成,为临床治疗子宫内膜损伤等缺血性疾病提供基础。第三章月经血子宫内膜干细胞改善子宫内膜纤维化的作用研究目的:探索Hh信号通路在子宫内膜纤维化过程中作用,并研究MenSCs在子宫内膜纤维化中的作用。材料和方法:qRT-PCR分析宫腔粘连患者子宫内膜中Gli2和纤维化相关蛋白关系的关系;并通过过表达和抑制实验验证Gli2对ESCs细胞周期和纤维化水平的作用。收集MenSCs培养液分析MenSCs旁分泌作用对间质细胞(ESCs)中Gli2及纤维化水平的作用。结果:我们证明首次证实转录因子Gli2在子宫内膜纤维化中发挥重要作用,过表达Gli2可促进间质细胞细胞周期的进程,促进上调纤维化水平;而smo抑制剂cyclopamine可抑制ESCs细胞周期的进程并减低纤维化。此外,MenSC-CM还可下调Gli2的表达,诱导ESCs中的细胞周期停滞并阻止纤维化相关蛋白表达。结论:转录因子Gli2在子宫内膜纤维化过程中起促进作用;MenSCs旁分泌作用能够抑制Gli2表达从而达到抗纤维化的作用。