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目的:1.筛选并验证子宫内膜异位症中差异表达的长链非编码RNA(lncRNA)。 2.推导子宫内膜异位症发展过程的上皮-间质转化(EMT)现象。 3.探索长链非编码RNA肌动蛋白丝相关蛋白1反义RNA1(lncRNA AFAP1-AS1)与子宫内膜异位症EMT现象的关系的机制及与转录因子ZEB1的关系。 方法:1.采用荧光定量 qRT-PCR方法测定所筛选的 AFAP1-AS1, KLKP1, HNF1A-AS1,H19,UCA1,MALAT-1等的mRNA在不孕的子宫内膜异位症患者的异位组织、配对在位组织及非内异症患者(输卵管性不孕患者)正常组织中的含量。 2.应用免疫组化方法及荧光定量 qRT-PCR技术检测子宫内膜异位症患者内膜组织中上皮-间质转化(EMT)标志蛋白ZEB1,N-钙黏素(N-cadherin),波形蛋白(Vimentin),E-钙黏素(E-cadherin),角蛋白(Keratin)的表达情况。 3.采用慢病毒转染子宫内膜异位间质细胞及Ishikawa细胞,构建AFAP1-AS1下调的细胞模型,并采用qRT-PCR分析AFAP1-AS1的下调效率。 4.应用qRT-PCR和WB凝胶电泳方法检测AFAP1-AS1下调后EMT标志蛋白及小GTP家族相关基因和蛋白的改变。 5.采用MTT、EdU、wound healing、transwell、ELISA等实验分析AFAP1-AS1下调后原代子宫内膜异位细胞形态、增殖能力、转移、侵袭能力和炎症因子分泌的变化。 6.采用荧光素酶报告基因的方法研究 AFAP1-AS1对 EMT相关转录因子ZEB1启动子位点pGL3-P886活性调节的影响。 7.采用体内实验,裸鼠皮下成瘤方法研究AFAP1-AS1对子宫内膜异位症的作用。 结果:1.子宫内膜异位症中LncRNA AFAP1-AS1的表达含量异常,主要体现在异位组织中显著高于在位组织,在位组织中又高于正常组织。 2.EMT过程存在于子宫内膜异位症中,其中E-cadherin,Keratin在在位组织中高表达于异位组织,而N-cadherin,Vimentin在异位组织中高表达于在位组织, ZEB1在异位组织及在位组织中均高表达于正常组织。 3.慢病毒感染效率强,下调AFAP1-AS1效率约70%。 4.下调原代子宫内膜异位细胞和ishikawa细胞系中AFAP1-AS1的含量以后, EMT标志蛋白的表达发生了显著变化,E-cadherin,Keratin表达上升,而N-cadherin, Vimentin及ZEB1表达下降,小GTP家族标志基因也发生一定的改变。 5.下调原代子宫内膜异位细胞中AFAP1-AS1的含量以后,细胞形态由纤维样的梭形向上皮样的多边形改变,增殖力、侵袭和转移的能力被显著削弱,炎症因子表达也减少。 6.下调AFAP1-AS1的表达以后,可以明显抑制E2对EMT相关转录因子ZEB1的启动子位点pGL3-P886活性的促进作用。 7.下调AFAP1-AS1的表达以后,裸鼠皮下成瘤明显减小。 结论:AFAP1-AS1在子宫内膜异位症中表达差异明显,其下调可以抑制 E2诱导的EMT相关转录因子ZEB1启动子pGL3-P886位点的活性,提示AFAP1-AS1可能诱导内异症的发展,且其发病机制可能与EMT有关。