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背景:原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)是一种慢性进展性胆汁淤积性自身免疫肝病,特异性损伤肝内胆管上皮细胞(Intrahepatic Biliary epithelial cells,IBECs),间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植治疗自身免疫病是一项新技术,多项临床观察显示MSCs治疗PBC有一定疗效,现认为MSCs可下调信号传导与转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)并促进细胞自噬,MSC是否对PBC肝内BECs自噬有影响未见报道。因此本实验以MSC对STAT3的调控与IBECs自噬关系为靶点,旨在进一步揭示IBECs的损伤机制,为MSCs治疗PBC患者IBECs损伤提供依据。目的:本研究旨在观察异基因脐带间充质干细胞(Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UCMSCs)移植治疗小鼠PBC模型疗效,探索MSCs对IBECs自噬的调控作用及分子机制,为治疗PBC提供理论依据。方法:体内试验:30只雌性C57BL/6小鼠(SPF级)随机分为实验组(n=18)、对照组(n=6)和未处理组(n=6)。18只实验组使用2-辛炔酸(2-OA)-牛血清白蛋白(BSA)+弗式佐剂/不完全弗氏佐剂(CFA/IFA)腹腔注射,对照组腹腔注射等量的BSA+IFA,未处理组无药物干预。22周后模型小鼠随机取2只,对照组小鼠、未处理组各1只小鼠观察造模情况;然后将PBC模型鼠随机分为以下处理组:模型组(PBC组,n=4)、MSCs移植治疗组(MSCs组,n=6)和STAT3抑制剂治疗组(Stattic组,n=6)。22-24周造模成功后MSCs组小鼠经尾静脉注射1×10~6 UCMSCs,PBC组注射等量生理盐水,stattic组注射含25%的150μl Stattic。治疗后两周处死所有小鼠,留取血清;MSCs组、Stattic组、对照组、未处理组随机各选取2只小鼠,进行肝脏病理HE及免疫组化染色;其余小鼠采用灌流法分离肝内胆管树纯化IBECs,免疫组化法检测细胞角蛋白19(CK19)和肝细胞核因子4α(HNF-4α),鉴定纯化的IBECs。测小鼠体重,取脾脏称量重量;全自动生化仪检测小鼠肝脏血清学指标;ELISA检测小鼠血清丙酮酸脱氢酶复合物E2亚单位(PDC-E2)抗体滴度。收集对照组、PBC未治疗组、MSCs移植组、Stattic治疗组小鼠IBECs,通过Western blot检测IBECs内STAT3/pSTAT3,p62、LC3、PKR/pPKR、Beclin-1、eIF2α/peIF2α、LAMP-1;RT-PCR检测STAT3、LC3和p62-mRNA,电镜下观察各组IBECs内自噬泡形成情况。体外实验:HiBECs分为3组:1)对照组:无药物处理;2)PBC组:甘氨鹅脱氧胆酸盐(Glycochenodeoxcholate,GCDC)处理;3)MSCs共培养组:GCDC处理的HiBECs与UCMSCs用Transwell小室共培养。分别在0h、2h、6h、12h、24h、36h、48h、54h、60h收集细胞,western blot测定各组LC3-II、LC3-I、STAT3/pSTAT3、PKR/pPKR、eIF2α/peIF2α蛋白表达,mCherry-GFP-LC3偶联双荧光蛋白检测PBC组及MSCs共培养组HiBECs细胞自噬通量;通过特异siRNA转染,沉默HiBECs内STAT3的表达,检测0h、6h、12h、48h、60h PBC组与MSCs共培养组上述自噬相关蛋白的表达。结果:(1)2-OA诱导22周后,PBC模型小鼠出现血清高滴度抗PDE-2抗体,血清谷酰转肽酶、乳酸脱氢酶、球蛋白和腺苷脱氨酶水平升高(P<0.05);肝脏病理显示汇管区淋巴细胞浸润,小胆管损伤类似慢性非化脓性胆管炎,并散在肉芽肿形成;MSCs和Stattic治疗组小鼠肝脏汇管区炎性细胞浸润少,未见肉芽肿形成,与对照组对比,PBC未治疗组血清谷酰转肽酶、乳酸脱氢酶、球蛋白、腺苷脱氨酶水平升高(P<0.05)。与未治疗组相比,MSC移植组谷酰转肽酶水平显著下降(P<0.05);PBC未治疗组PEC-E2水平较其他组显著升高。(2)PBC模型组小鼠IBECs自噬蛋白Beclin-1以及STAT3、pSTAT3较对照组升高(P<0.05),MSCs移植及Stattic治疗组上述蛋白均下降(P<0.05),PBC模型组的STAT3-mRNA、p62-mRNA低于对照组(P<0.05),MSCs移植组p62高于PBC模型组(P<0.05);(3)体外加入GCDC诱导48h后,HiBECs自噬最明显,MSCs共培养组pSTAT3低于PBC组,沉默STAT3后,PBC组细胞自噬水平升高、MSCs共培养组细胞自噬水平持续下降,各组细胞的peIF2α、PKR均下降;荧光蛋白显示MSCs组在60h自噬通量仍高于PBC组。结论:成功建立2-OA-BSA诱导的PBC小鼠模型;UCMSCs移植能通过下调STAT3减轻PBC模型鼠肝脏汇管区损害,可能与调控小鼠体内自噬相关蛋白有关。MSCs共培养可通过下调STAT3影响PKR/eIF2α通路,从而在HiBECs的自噬小泡形成阶段和溶酶体阶段增强细胞自噬通量。这些发现提示MSCs可能通过调控自噬相关蛋白治疗PBC。本研究将为临床开展MSC移植治疗PBC提供依据。