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鼠单抗6D11(6D11 mAb)是本实验室利用高复制的HBV转基因小鼠模型,筛选得到的针对乙型肝炎病毒(HBV)外膜蛋白上的一个特定表位的抗体,它能有效并持久清除转基因小鼠体内的乙肝病毒及乙肝表面抗原(HBsAg)。在前期研究工作中,我们已经成功将其改造成嵌合抗体形式(6D11cAb),但嵌合抗体的鼠源可变区仍能诱导人体产生人抗鼠抗体(HAMA)反应,基于治疗性抗体研发的目的,需要对6D11 cAb的可变区进一步人源化。本研究主要是利用噬菌体展示技术对6D11 cAb的可变区进行CDR移植和FR区的优化,以进一步提高6D11cAb的人源化程度,同时保留其生物活性。首先,通过搜索数据库,确定了以序列同源性最高的人胚系基因4-28-02和2D-28-01作为改造模板。通过分析人源、鼠源序列中差异氨基酸的性质相似性以及空间位置对CDR区的影响,对不确定的重链的20个氨基酸和轻链的6个氨基酸进行突变,将人源、鼠源两种氨基酸同时编入人源化设计序列中,利用简并引物,通过重叠延伸PCR技术构建了 6D11人源化噬菌体单链抗体库,实际有效库容达到5×107。采用抗原直接包被酶联免疫板和“捕获法”两种固相筛选法,对抗体库进行了三轮筛选,获得了 20条人源化抗体序列,选取其中10条优势序列构建入PTT5真核表达载体,瞬时转染CHO-S细胞进行完整抗体表达。从与抗原反应性、体内病毒清除效果、中和活性三方面进行抗体评估,获得了编号为B-S3-45的活性最优抗体,其人源化程度为89.94%。B-S3-45与抗原的反应性与6D11 cAb相似,EC50浓度约为3 ng/mL;在HBV转基因小鼠体内能持续有效抑制HBVDNA和HBsAg达5天;进行细胞中和实验时,290 ng/mL的抗体浓度就使病毒感染抑制率达到50%,2500 ng/mL的抗体浓度时病毒感染抑制率达到90%。此外,还发现6D11cAb的结合活性相比于6D11mAb明显降低。因此,构建并表达了重组抗体B45-mC,其可变区为B-S3-45的序列,恒定区为鼠源序列,经活性验证,B45-mC的抗原结合能力和病毒中和能力比B-S3-45分别提高了 14倍和2倍,表明恒定区是影响6D11 cAb及其人源化抗体生物活性的因素之一,提示针对抗体恒定区序列的优化和改造是进一步提高6D11人源化抗体亲和力的重点方向。