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病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis,VNN)可引起鱼类病毒性神经坏死,是我国水产养殖中危害最大的病毒性疾病之一,特别是在我国东南沿海地区较为常见。该传染病的病原体为神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV),据报道,已有30多种海鱼在苗期和培养过程中受到VNN的影响,特别是对石斑鱼仔鱼和幼鱼造成很高的死亡率,给海洋鱼类养殖造成严重的经济损失。目前用于防治该病的疫苗主要是通过注射方式免疫的,但由于注射免疫的局限性。本实验旨在研究制备一种能通过粘膜免疫(口服粘膜免疫和浸泡粘膜免疫)石斑鱼从而有效防治病毒性神经坏死病的粘膜疫苗,以至于能够打破传统免疫的局限性。鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)是一种革兰氏阴性兼性胞内病原体,可引起鲶鱼(ESC)的肠败血症。该疾病最初被发现是在1976年的佐治亚州和阿拉巴马州的垂死鲶鱼中,它可以通过胃肠道、鳃、皮肤等粘膜组织或口腔、鼻孔(鼻子)进入鱼体引发斑点叉尾鮰肠败血症。研究表明鮰爱德华氏菌编码的外膜蛋白(OMP)N具有参与粘附和侵袭,赋予其毒力属性。其中编码的omp N1蛋白参与了鞭毛在内膜和外膜之间的肽聚糖层的锚定以及参与蛋白信号的转导,并且容易被受感染的宿主识别,所以我们认为omp N1蛋白具有跨膜作用,在鮰爱德华氏菌的跨粘膜致病机制中扮演一个重要的角色。Crp和Ton B蛋白是鮰爱德华氏菌编码的另外两种蛋白,他们参与ESC的发病过程,是E.ictaluri的重要毒力因子。综上所述,可以根据鮰爱德华氏菌的跨粘膜致病机理,并敲除其致病蛋白,将原本不具备黏膜免疫作用的鱼类神经坏死病毒的外壳蛋白MCP敲入到鮰爱德华氏菌的基因组并表达,制备相应的粘膜疫苗。目的:将鮰爱德华氏菌的外膜蛋白N1(omp N1)和神经坏死病毒的衣壳蛋白(MCP)融合,在工程菌中表达并纯化出一种具有跨粘膜免疫的基因重组融合蛋白(MCP-omp N1),为制备抗鱼类病毒性神经坏死病的粘膜免疫疫苗奠定基础。其次利用细菌基因编辑技术敲除鮰爱德华氏菌的潜在致病基因Ton B和Crp,并将神经坏死病毒的衣壳蛋白(MCP)基因敲入到缺失△Ton B的弱毒鮰爱德华氏菌基因组和野生型鮰爱德华氏菌的基因组并表达,获得的新菌株可用于制备预防神经坏死病毒和鮰爱德华氏菌的粘膜免疫疫苗。方法:1.利用从NCBI Gen Bank库里获得鱼类神经坏死病毒的外壳蛋白M CP与鮰爱德华氏菌的外膜蛋白omp N1的基因序列,并将两者进行了序列优化与全基因合成。分别构建原核表达载体:MCP-omp N1 p ET28a、MCP p ET28a、o mp N1 p ET28a,在大肠杆菌内分别诱导表达融合蛋白MCP-omp N1、MCP、omp N1,且利用包涵体纯化及透析复性获得MCP-omp N1、MCP、omp N1蛋白。然后利用纯化后MCP、omp N1蛋白作为抗原免疫小鼠,通过ELISA检测小鼠血清总Ig G水平和Western-blot检测抗血清的特异性。2.针对致病基因Crp和Ton B的敲除,分别构建基因敲除重组载体:Crp-sg RNA1-Donor SX Pcrispr、Crp-sg RNA3-Donor SX Pcrispr、Ton B-sg RNA-Donor SX Pcrispr,这些重组质粒分别电转化至鮰爱德华氏菌感受态细胞中,通过双抗性筛选、PCR、测序验证最终筛选出成功敲除Crp和Ton B的弱毒鮰爱德华氏菌株。3.外源基因MCP的敲入,分别构建基因敲入重组载体:MCP-Δ Ton B pK18mobsac B、MCP-p K18mobsac B,分别电转化至弱毒鮰爱德华氏菌株及野生型鮰爱德华氏菌中,依次通过卡那抗性、20%蔗糖、PCR、测序验证,最终获得成功敲入外源基因MCP的菌株。结果:1.SDS-PAGE结果显示原核表达纯化得到了较纯的MCP-omp N1融合蛋白,进一步的ELISA检测结果显示与PBS组相比,MCP及omp N1组的小鼠血清总Ig G水平显著升高。Western Blotting结果也表明了纯化得到MCP-omp N1融合蛋白具有MCP抗原性,也具有omp N1抗原性。2.基因敲除实验结果显示,电转化后通过卡那及氯霉素双抗性筛选出阳性单克隆,通过将其基因组提取后进行PCR,将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,发现在目的条带均与未编辑的阴性对照基因小。再通过测序序列结果比对,结果显示△Crp1部分序列敲除及发生突变,△Crp3相比于原始Crp基因在372-452 bp处缺失80 bp,△Ton B相比于原始Ton B基因在336 bp～415 bp处缺失79 bp。以上的实验结果证明成功敲除了Crp和Ton B基因,获得弱毒活E.ictaluri菌株。3.卡那抗性和20%蔗糖筛选阳性单克隆,通过将其基因组提取后进行PCR,琼脂糖凝胶电泳鉴定,发现目的条带均与未编辑的阴性对照条带大1 kd左右。再通过测序序列比对结果显示,之所以目的条带均比未编辑的阴性对照大,是因为外源基因MCP已成功敲入弱毒鮰爱德华氏菌株和野生型鮰爱德华氏菌的基因组。结论:本实验原核表达纯化得到了鱼类神经坏死病毒衣壳蛋白MCP和鮰爱德华氏菌外膜蛋白omp N1的融合蛋白MCP-omp N1,为进一步验证融合蛋白MC P-omp N1能否作为抵抗神经坏死病毒的粘膜疫苗奠定了基础。Crisprca9成功的对E.ictaluri的Crp和Ton B基因进行敲除,获得△Crp的弱毒鮰爱德华氏菌株(Edwarsiella ictaluri str.CrpΔCrp)和△Ton B的弱毒鮰爱德华氏菌株(Edwars iella ictaluri str.Ton BΔton B),为将外源神经坏死病毒的衣壳蛋白MCP基因敲入及用于制备抗鮰爱德华氏菌养殖业的浸泡/口服疫苗奠定基础。自杀质粒敲除系统成功的将神经坏死病毒衣壳蛋白MCP基因敲入,分别获得新的弱毒鮰爱德华氏菌株(Edwarsiella ictaluri str.TOM ton B::mcp)和灭活野生型鮰爱德华氏菌株(Edwarsiella ictaluri str.MCP mcp),该菌株可用于制备预防神经坏死病毒和鮰爱德华氏菌的粘膜免疫疫苗。