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研究背景辅助生殖技术(ART)显著改善了不孕症的治疗和妊娠结局,然而不明原因的反复着床失败(RIF)仍然是影响ART结局的主要问题。其中子宫内膜容受性低及母胎界面免疫异常是导致RIF的关键因素。巨噬细胞(Mφ)作为一种免疫吞噬细胞,在围着床期子宫内膜聚集,对于维持正常女性的生殖活动必不可少。子宫内膜容受性的建立需要Mφ分泌炎症因子介导炎症反应。已有研究发现分泌蛋白Dickkopf-3(DKK3)可影响炎性病灶中Mφ的募集,然而其在生殖生物学中的功能尚不明确。阐明DKK3对子宫内膜Mφ的募集转化作用,可为进一步探究胚胎着床的分子机制及解决部分RIF患者的临床问题提供理论基础。研究目的探究子宫内膜中DKK3的围着床期和月经周期性动态表达情况以及DKK3对Mφ的募集和转化作用。研究方法第一部分,设置妊娠小鼠第1、4、5、8天(D1、D4、D5、D8)作为实验组,未孕雌性小鼠作为对照组,收集相应子宫标本。同时收集行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者增殖中期及分泌中期子宫内膜样本。通过苏木精-伊红染色(HE染色)观察子宫及子宫内膜的形态学,然后通过免疫组织化学染色法检测子宫内膜中DKK3的表达量,以及F4/80和CD206分别标记的M(φ数量。第二部分,细胞实验选取对数生长期RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系)进行以下实验:(1)Transwell小室细胞迁移实验观察不同浓度DKK3对RAW264.7细胞迁移的作用;(2)MTT实验检测不同浓度DKK3对RAW264.7细胞增殖的影响;(3)实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)分别检测不同浓度及时间DKK3处理RAW264.7细胞后M1型及M2型巨噬细胞表面标志物及特异性可溶介质的mRNA和蛋白的相对表达量。动物实验选取雌性小鼠,向子宫角内灌注浓度分别为0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml的DKK3溶液作为实验组,对照组注射等量PBS溶液,选择3小时或8小时作为处死时间并收集小鼠子宫标本。利用免疫组织化学染色法检测子宫内膜中F4/80和CD206分别标记的Mφ数量。结果第一部分:(1)HE染色显示小鼠受孕,受孕后子宫基质细胞发生蜕膜化;(2)小鼠子宫免疫组织化学染色显示,DKK3在小鼠子宫内膜基质中的表达随着妊娠天数增加而逐渐增加,并于D5达到顶峰。在蜕膜区域中,DKK3的表达较未分化的内膜基质区域减少,其中D8着床点周围蜕膜区域DKK3的表达高于非着床点;(3)在妊娠小鼠子宫内膜基质中,F4/80标记的Mφ数量及CD206标记的M2型巨噬细胞数量随着妊娠天数增加而逐渐增加,并分别于D4和D5达到顶峰。在蜕膜区域中Mφ及M2型巨噬细胞数量均较未分化的内膜基质区域减少,但M2型巨噬细胞比例增高,其中D8着床点周围蜕膜区域M(φ及M2型巨噬细胞数量均显著高于非着床点;(4)人子宫内膜免疫组织化学染色结果显示,分泌期子宫内膜基质中DKK3表达高于增殖期;(5)人子宫内膜分泌期F4/80标记的Mφ和CD206标记的M2型巨噬细胞的数量均高于增殖期,M2型巨噬细胞比例也较增殖期增高;(6)Pearson相关性分析显示子宫内膜中DKK3的相对表达量与F4/80标记的Mφ数量中等程度正相关,而与CD206标记的M2型巨噬细胞数量强正相关。第二部分:(1)Transwell小室细胞迁移实验显示DKK3能促进RAW264.7细胞迁移;(2)MTT实验显示DKK3对RAW264.7细胞增殖无影响;(3)qRT-PCR及Western Blot显示DKK3处理RAW264.7细胞的剂量效应及时间效应对部分M1型及M2型巨噬细胞表面标志物或特异性可溶介质的mRNA和蛋白的相对表达量存在显著影响;(4)小鼠子宫灌注实验中,HE染色显示8小时处理组较3小时处理组子宫内膜基质水肿更为明显,免疫组织化学染色显示DKK3灌注液对RAW264.7细胞处理的时间效应及剂量效应对子宫内膜F4/80标记的M(φ数量以及M2型巨噬细胞比例均有影响。结论(1)子宫内膜DKK3和Mφ在围着床期和月经周期不同时期的表达具有时空差异性;(2)DKK3能刺激M(φ的迁移并参与募集子宫内膜Mφ;(3)DKK3可以诱导Mφ向M1或M2型巨噬细胞转化,可能存在双向调节作用。