论文部分内容阅读
PUMA是2001年发现的一种促凋亡蛋白,最早发现于直结肠癌细胞中。该基因可以被p53快速诱导,具有强大的促凋亡的作用,故称其为puma。它属于凋亡相关蛋白Bcl-2家族,仅拥有一个BH3结构域,是促凋亡蛋白BH3-only亚族的重要成员。BH3-only亚族通过变构效应调节Bcl-2家族促凋亡和抗凋亡成员的平衡,在凋亡信号通路中处于中心位置。既往研究表明PUMA基础表达量较低,在各种应激刺激(如DNA损伤,缺氧,糖皮质激素刺激及血清撤除等)影响下,可以通过p53依赖和非依赖两种途径被诱导表达,发挥着重要的促凋亡作用。由上述应激因素所诱导的细胞凋亡过程中,PUMA的作用是必需的,也就是说没有PUMA参与,就不会引发细胞凋亡。现有研究表明puma是p53的直接靶基因,也是介导p53凋亡通路的主要媒介分子。在研究人类结直肠癌细胞中PUMA介导的细胞凋亡的分子机制时发现,PUMA通过其BH3结构域分别和Bcl-2家族多种抗凋亡成员(如Bcl-XL、Bcl-2等)产生广泛的相互作用,使原本结合于抗凋亡蛋白上的Bax解离并多聚化,进而转位激活线粒体依赖的内源性凋亡通路,诱导结肠癌细胞凋亡。此外Bax的缺失也会引起细胞凋亡障碍。因此PUMA对Bax的调控可能是一条重要的细胞凋亡通路。我们的前期工作已经发现促凋亡基因puma在肝脏再生早期下调了5倍,其下调的意义是什么?是否提示PUMA低表达对肝细胞增殖的发动有显著作用?puma基因是否是调控肝脏再生的重要或关键靶点?其调控的机制是什么?我们对这些问题非常有兴趣,希望通过在体、离体实验揭示其规律。本课题通过离体实验研究PUMA对小鼠肝细胞凋亡的影响及其分子机制,对进一步揭示puma在肝脏再生过程中的作用有重要意义。同时,PUMA腺病毒有作为基因治疗药物的广阔应用前景(Biomed Pharmacother,2007)。运用腺病毒载体进行肝细胞离体实验研究,有助于初步了解PUMA腺病毒作为在体进行基因治疗的载体及其对正常肝细胞毒副作用。课题研究的内容包括以下三个主要部分:1.用HEK293 low passage(LP)细胞包装制备重组PUMA腺病毒(Ad-puma)和GFP(Ad-GFP)腺病毒及其鉴定。我们实验用239LP细胞反复包装多次制备的PUMA腺病毒存储液。经Millipore 10 kDa超滤离心管浓缩富集后得到浓缩病毒液。通过普通PCR、Westernblot检测证明Ad-PUMA在目的细胞中有效高表达。且Ad-GFP在BNL CL.2细胞中有效表达绿色荧光蛋白。通过壳蛋白免疫法、GFP荧光法计算Ad-PUMA和Ad-GFP的感染性滴度,所制备的病毒浓缩液Ad-PUMA的滴度为2.0×108 ifu/ml;Ad-GFP滴度为2.1×109 ifu/ml。为进一步的生物学实验打下了良好的基础。2.过表达PUMA后,对小鼠肝细胞BNL CL.2生物学功能的影响(包括周期和凋亡等生物学功能指标)。在该部分生物学功能实验中,以MOI=8的Ad-PUMA和Ad-GFP感染细胞。经流式细胞仪检测分析ANNEXINⅤ标记的早期凋亡细胞,Ad-PUMA感染组比Ad-GFP对照组早期凋亡细胞高出约10倍;Hoechst 33342核染色发现,BNL CL.2细胞有明显的细胞凋亡形态特征,且随时间点推移凋亡细胞数明显增加;同时实验中我们利用Westernblot还检测发现,Puma介导的细胞凋亡效应也与线粒体凋亡通路Caspase级联效应有关。G0期同步化后的细胞周期发现,36小时S期细胞明显增多。36小时S/G2期细胞比Ad-GFP感染组和阴性对照组高出近4倍。PUMA过表达后可能使细胞从S期发展为G2期时发生了停留或阻滞。联系先前实验中puma在过程肝再生中下调,puma基因通过对肝细胞凋亡的调节和对细胞周期的影响参与到肝再生过程中。3. PUMA对肝细胞生物学功能影响的分子机制研究。我们运用免疫共沉淀实验进一步分析了BCL-2家族成员间在PUMA介导的凋亡中的相互作用。实验中分别研究PUMA、Bax与Bcl-XL的关系时发现:在腺病毒介导的PUMA过表达后,运用PUMA、Bax共沉淀抗体均可沉淀出Bcl-XL,即PUMA和Bax均可强烈结合Bcl-XL。而且Bax与Bcl-XL的结合,随时间点推移减低。在存在争议的PUMA与Bax的相互作用中,我们发现无论是HA共沉淀抗体pulldown检测Bax,还是用Bax共沉淀抗体pulldown检测PUMA,PUMA都能与Bax结合。因此我们推断,在BNL CL.2细胞中,PUMA促凋亡的分子机制既可能是通过与Bax竞争性结合Bcl-XL从而释放Bax,改变线粒体膜通透性而促凋亡,也可通过PUMA直接激活Bax的方式起作用。