神经退行性疾病是一组以慢性进行性中枢神经组织退行性变性为特征的神经系统疾病。主要包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)、肌萎缩侧索硬化症等。其中以AD和PD发病率最高,最为常见。神经退行性疾病严重影响老年人的身体健康和生活质量,随着中国老龄化社会的到来,对此类疾病的研究意义重大。科研工作者正在努力探索该类疾病的发病机制,寻找并鉴定新的药物靶点,开发有效预防和治疗神经退行性疾病的药物。FLZ是从番荔枝叶中分离出的番荔枝酰胺进行结构改造而得到的一种新型化合物。前期研究证实FLZ具有较强的神经保护作用,具有开发为治疗神经退行性疾病药物的前景,目前在申报临床试验中。本论文主要目的是对FLZ的神经保护作用机制进行深入的研究。本论文主要包括以下内容。第一章：FLZ通过抑制Src酪氨酸激酶减弱神经炎症并保护多巴胺能神经元。第二章：FLZ对APP瑞典型突变(APP Swedish mutation, APPSwe)过表达导致的线粒体损伤的保护作用。第一章FLZ通过抑制Src酪氨酸激酶减弱神经炎症并保护多巴胺能神经元过度活化的小胶质细胞介导的神经炎症参与PD的发病及病理过程。抑制过度活化小胶质细胞介导的神经炎症可保护神经元,具有治疗PD的作用。前期研究证实番荔枝酰胺衍生物FLZ可抑制过度活化的小胶质细胞,具有很强的神经保护作用,但具体作用机制仍然不十分清楚。本研究旨在应用经典致炎剂脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)建立的体内、外神经炎症PD模型考察FLZ的神经保护及抑制神经炎症作用,进一步明确FLZ抑制神经炎症的作用机制,发现抑制神经炎症的新靶点。体内采用大鼠黑质内定点注射LPS作为神经炎症PD模型,考察FLZ的神经保护和抑制神经炎症作用。结果显示,FLZ可显著改善LPS诱发的PD模型大鼠行为学障碍并对黑质内多巴胺能神经元具有较强的保护作用,提高大鼠纹状体内的多巴胺(Dopamine, DA)含量并降低DA翻转率。FLZ可显著抑制大鼠黑质内小胶质细胞活化。实时定量RT-PCR结果表明,FLZ可显著抑制促炎症细胞因子TNF-a和MCP-1mRNA的表达。应用LPS刺激BV2小胶质细胞株作为体外神经炎症模型,考察FLZ抑制神经炎症的作用及机制。研究发现,FLZ可显著抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞活化,如：FLZ可抑制Src酪氨酸激酶介导的炎症信号通路活化,最终抑制核转录因子-κBp65(Nuclear transcription factor-KBp65, NF-κBp65)核易位；减少细胞内一氧化氮(Nitric oxide, NO)及活性氧(Reactive oxygen species, ROS)生成；抑制还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶亚单位p47Phox和p67phox膜易位及NOX-2表达。敲除Src酪氨酸激酶可导致LPS诱导的NADPH氧化酶和小胶质细胞活化受抑制,同时FLZ抑制炎症的作用也随之削弱。以上机制研究表明,Src酪氨酸激酶在小胶质细胞激活及FLZ神经保护过程中发挥重要作用。本研究证实了FLZ具有较强的神经保护和抑制神经炎症作用。FLZ的神经保护作用与其抑制小胶质细胞过度活化及保护黑质部位的多巴胺能神经元密切相关。机制研究表明,Src酪氨酸激酶是FLZ抑制神经炎症的重要靶点。第二章FLZ对APPswe过表达导致的线粒体损伤的保护作用AD的发病机制复杂,目前尚没有一种学说能够比较合理、全面的解释AD的发病机制。自2004年线粒体功能紊乱级联假说的提出,使得线粒体功能障碍在AD发病机制中的重要作用受到广泛关注。在线粒体级联假说的基础上,我们提出p淀粉样蛋白(Amyloid beta, Aβ)引起的线粒体损伤可能与脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)转运障碍之间存在联系。p淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)剪切异常及Ap生成增多诱发线粒体功能损伤,继而引发神经元的轴突转运障碍,BDNF-受体酪氨酸蛋白激酶B(Tyrosine protein kinase B, TrkB)信号作用因此而减弱,最终引发AD。Ap诱导的线粒体损伤及BDNF转运障碍与AD的发病密切相关。本课题组前期研究发现,FLZ在多种AD模型中可改善模型动物的行为学障碍及学习记忆功能。初步机制研究认为,FLZ可能通过保护线粒体和抑制神经元凋亡发挥神经保护作用。此外,FLZ可增强AD模型动物脑内BDNF信号。本研究旨在考察FLZ对APPSwe过表达导致线粒体损伤的保护作用；并在前期研究工作的基础上,继续探讨APPSwe过表达是否通过引起线粒体损伤造成轴突转运障碍,从而减弱BDNF信号的作用。我们应用APPswe慢病毒感染原代海马神经元,慢病毒运载系统的基因导入效率很高,可导致APP蛋白表达水平上调。APPswe过表达可导致线粒体内过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)生成显著增多,线粒体细胞色素氧化酶活性降低,并引起细胞内三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)含量减少。此外,APPswe过表达可上调线粒体分裂相关蛋白DRP1的表达,下调线粒体融合相关蛋白OPA1和MFN1的表达。APPswe过表达导致线粒体功能障碍及动力学异常。FLZ可抑制APPswe过表达导致的线粒体内H202生成及细胞色素氧化酶活性降低,还可调控线粒体分裂相关蛋白DRP1表达,表明FLZ通过改善由APPswe过表达导致的线粒体损伤,发挥线粒体保护作用。我们应用表达载体在293T细胞中成功表达出了BDNF-RFP, BDNF-RFP用于研究APPswe过表达对BDNF信号作用的影响。APPSwe过表达可减少原代海马神经元对BDNF-RFP的摄取。APPAswe过表达抑制了BDNF-TrkB下游Akt和GSK3β的磷酸化,减弱了BDNF信号的作用。以上研究表明,APPswe慢病毒感染可减弱原代海马神经元摄取BDNF-RFP, BDNF-TrkB下游信号通路中关键蛋白的磷酸化也被抑制。APPSwe过表达导致的线粒体损伤可能介导了AD相关的BDNF信号作用障碍。FLZ可改善线粒体的功能,抑制APPSwe过表达引起的线粒体分裂相关蛋白DRP1表达上调,具有线粒体保护作用。