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第一部分自噬相关蛋白p62介导的破骨细胞形成目的：本实验旨在研究自噬的特异性衔接蛋白p62在RANKL诱导的破骨细胞分化过程中的作用。方法：通过RANKL诱导破骨前体细胞RAW264.7形成破骨细胞,利用实时定量PCR及免疫印迹实验检测破骨细胞分化过程中自噬相关基因及蛋白的表达水平。与此同时,通过免疫细胞荧光双染检测自噬相关蛋白p62、LC3与肌动蛋白环之间的位置关系。进而通过小RNA干扰实验抑制RAW264.7细胞中p62的表达,检测破骨细胞形成过程中自噬的活化水平、破骨细胞的分化能力以及肌动蛋白环的形成能力。结果：在RANKL诱导的破骨细胞分化过程中检测到包括p62在内的几种自噬相关蛋白表达水平升高。免疫印迹实验显示在RANKL诱导的破骨细胞形成过程的开始阶段p62蛋白的表达下调,并且随着时间的推移表达逐渐增多。这种p62蛋白的表达下调可能与LC3-II/LC3-I蛋白比的升高有关,表明此过程中自噬降解的p62蛋白的存在。免疫荧光双染结果显示破骨细胞的肌动蛋白环中p62蛋白的表达下调,与LC3在肌动蛋白环中的表达上调成负相关。更重要的是,抑制破骨前体细胞中p62的表达后,破骨细胞形成过程中自噬相关的基因和破骨细胞分化相关的基因表达明显下调,而且TRAP阳性的破骨细胞数目和肌动蛋白环的形成均受到明显抑制。结论：研究证实衔接蛋白p62在RANKL诱导的自噬及破骨细胞形成过程中具有的重要作用。第二部分膜纳米管介导的物质传递对破骨细胞分化的影响目的：探究内皮细胞(EPCs)和破骨前体细胞(RAW 264.7 cells)间膜纳米管(TNTs)的作用,进一步研究TNTs介导的物质传递对破骨前体细胞分化能力的影响。方法：首先对内皮细胞和破骨前体细胞进行不同荧光染料的染色,进而对这两种细胞进行直接共培养。通过扫描电子显微镜和免疫荧光法证明直接共培养体系中TNTs的存在。通过流式细胞术分选共培养体系中的细胞,进而通过侵袭小室实验和破骨细胞形成实验检测共培养后的破骨前体细胞的分化能力。通过免疫荧光检测共培养体系中两种细胞间物质的传递情况。在共培养体系中应用TNTs抑制剂进一步探究TNTs在内皮细胞和破骨前体细胞间物质传递中的作用机制。结果：通过扫描电子显微镜和免疫荧光法证实内皮细胞和破骨前体细胞间TNTs的存在,并且观察到TNTs介导的由内皮细胞向破骨前体细胞进行的物质传递。在直接共培养体系中应用TNTs抑制剂证明TNTs在这两种细胞间的物质传递中起重要作用。研究发现与内皮细胞共培养后的破骨前体细胞分化为成熟破骨细胞的能力下降。此外,还发现与内皮细胞共培养后的破骨前体细胞中MIF的表达升高。使用MIF抑制剂ISO-1可促进与内皮细胞共培养的破骨前体细胞形成破骨细胞的能力,以及破骨细胞形成相关基因表达的增高。结论：在内皮细胞和破骨前体细胞直接共培养体系中,内皮祖细胞通过膜纳米管样结构向破骨细胞传递MIF蛋白分子,从而抑制破骨细胞的迁移能力和分化潜能。第三部分自噬在人牙源性角化囊性瘤中的作用目的：检测人牙源性角化囊性瘤中自噬的活化水平,并且进一步研究自噬与其上皮增殖潜能的关系。方法：分别通过免疫组织化学和实时定量PCR的方法检测牙源性角化囊性瘤及根尖周囊肿中自噬相关分子的表达情况。应用斯皮尔曼相关性分析检测牙源性角化囊性瘤中自噬相关分子与Bcl-2或者Ki-67之间的相关性,并通过聚类分析进一步明确上述分子间的相关性。结果：在牙源性角化囊性瘤中,mRNA水平及免疫组织化学检测结果显示自噬相关蛋白的表达水平明显升高,且在牙源性角化囊性瘤中的表达水平显著高于根尖周囊肿中的表达水平。研究结果也显示抗凋亡分子标记物Bcl-2在牙源性角化囊性瘤中的表达显著升高。斯皮尔曼相关性分析发现在牙源性角化囊性瘤中高表达的Beclin 1、Atg7、LC3、p62相互之间有明显相关性,而且上述自噬相关分子与Bcl-2或Ki-67间密切相关。更重要的是,免疫组织荧光双染检测到牙源性角化囊性瘤中LC3与Ki-67之间存在着明显的共定位,而在根尖周囊肿中却没有检测到明显表达。结论：牙源性角化囊性瘤中自噬的活化水平升高,而自噬相关分子与牙源性角化囊性瘤上皮增殖标记物Ki-67间具有明显相关性。