磷(Phosphorus, P)作为植物生长发育所必需的元素之一,不仅是植物细胞的结构成分,还在植物细胞代谢调控及信号通路中发挥重要作用。由于土壤中植物可利用磷浓度较低,植物在响应磷饥饿过程中产生了形态、生化及分子应答等适应性机制。在适应的过程中涉及到改变根系的形态结构,实现增强对磷的吸收。这些变化与低磷胁迫下一些特定基因的表达调控密切相关。目前许多参与磷饥饿反应的基因已经被克隆,对磷的响应证实了这些基因在植物中的重要调控作用。本研究从拟南芥的基因组中克隆得到了一个编码CBL1的基因,并对该基因在低磷胁迫条件下的功能进行了研究,得到如下实验结果：1.AtCBL1基因的表达模式分析AtCBL1基因编码的蛋白属于CBL蛋白家族。通过实时定量RT-PCR分析了该基因在低磷胁迫的表达模式,结果显示该基因在低磷胁迫3h后开始表达并呈增长趋势,72h时该基因的表达仍处于较高水平。实验结果显示AtCBL1的表达受到低磷胁迫的诱导。2.AtCBL1启动子克隆及活性分析克隆约1.2Kb长度的AtCBL1启动子片段。通过构建AtCBL1P:GUS融合表达载体,转化拟南芥。组织化学分析显示在拟南芥幼苗的叶片和根尖有较弱的GUS活性。低磷胁迫处理分析表明AtCBL1基因启动子受低磷诱导。3.AtCBL1参与拟南芥低磷胁迫应答分析根据拟南芥数据库AtCBL1基因序列,设计引物通过RT-PCR克隆了AtCBL1全长ORF cDNA序列并构建入克隆载体pBluescript SK中。构建了AtCBL1过量表达载体并通过浸花发转化拟南芥,获得了AtCBL1表达显著提高的转基因拟南芥株系。此外,也从Salk研究所获得了T-DNA插入cbll突变体。通过基因组水平和转录水平鉴定,获得了cbll纯合突变体。以为AtCBL1过量表达株系和cbll突变体为材料,分析AtCBL1在拟南芥低磷胁迫应答中的功能。实验结果显示,在幼苗阶段,AtCBL1过量表达促进了拟南芥侧根发育,在低磷条件下转基因拟南芥侧根也明显增多；而cbll突变体侧根数目减少,并且低磷条件下主根对低磷胁迫不敏感,表现为相对野生型主根能够伸长。磷饥饿应答基因表达分析表明在AtCBL1过量表达转基因拟南芥中Phtl家族磷转运蛋白基因、IPS1、RNS1等基因表达上调,而在cbll突变体中,这些基因其中部分表达下调。而另一些磷饥饿应答基因,如PHR1、PHO2等基因在AtCBL1过量表达和cbll突变体植株中表达无明显差异。4.AtCBL1与AtCIPK17相互作用分析CBL1需与其靶蛋白CIPK相互作用才能发挥其功能将相关应答信号向下传递。为研究在低磷应答时CBLl的下游成员,通过酵母双杂交实验和表达分析,发现CBL1能够与CIPK17相互作用,表达模式分析也表明CIPK17参与低磷应答,这些数据显示在拟南芥中CBL1-CIPK17信号通路参与了低磷胁迫应答。5.AtCBL1上游调控因子的分析通过AtCBL1启动子序列分析发现其内部有2个W-box和3个P1BS顺式原件,其分别为WRKY家族转录因子和PHR1结合位点。通过EMSA实验分析表明AtCBL1启动子可以和PHR1相互作用,说明PHRl可能为AtCBL1上游调控因子。