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目的：
探讨交感神经在小鼠单纯疱疹病毒(HSV-1)性角膜炎病程进展中的重要作用以及交感神经过度生长在促进单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)炎症中的相关机制。
方法：
本研究选择HSV-1RE病毒株感染B6小鼠建立单纯疱疹病毒性角膜炎的小鼠模型。实验分以下两个部分进行研究：1.在感染后选取多个时间点对小鼠角膜情况进行临床评分并以照片和视频的方式记录保存。临床评分分为5个项目：眼睑皮肤病变，角膜浑浊程度，新生血管覆盖角膜的范围，角膜知觉测试，瞳孔大小。在HSV-1感染后采集小鼠角膜标本行免疫荧光染色。置于共聚焦显微镜下观察神经分布情况。2.①重新建立小鼠HSK模型，在感染后第14天和第28天收获角膜用CD4、F4/80及β2-肾上腺素受体(β2-AR)行免疫荧光染色，共聚焦显微镜扫描标本观察CD4+T细胞和巨噬细胞上的表情情况。在感染后第14天和第28天，将角膜细胞制成单细胞悬液，用CD45、CD4、F4/80、CD11b、Gr-1及β2-AR标记单细胞，流式细胞实验计数β2-AR表达阳性的免疫细胞。②HSV-1感染B6小鼠后用β2-AR受体拮抗剂噻吗洛尔和生理盐水分组进行球结膜下注射，临床评分估计HSK进展情况。治疗结束后行流式细胞实验计数CD4+T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，查看对照组和实验组免疫细胞数目变化。③将感染后第28天的小鼠脾脏细胞研磨并原代培养，加入浓度为100M的去甲肾上腺素或50M的噻吗洛尔刺激24小时后，采用流式细胞学实验方法检测CD4+T细胞上细胞内因子IFN-γ的表达情况。
结果：
1.①小鼠HSK病程进行临床评分的结果显示：HSV-1感染角膜后1-3天内角膜上皮出现点状、树状或地图状损伤。感染后7天出现角膜知觉下降。感染后15至20天被感染角膜表现为角膜混浊伴有溃疡、角膜知觉完全丧失以及全角膜范围的新生血管。角膜严重混浊、大范围新生血管及角膜知觉丧失都可持续至感染后至少70天(观察截止日期)②制备整个小鼠角膜标本行免疫荧光染色可见正常角膜的上皮/基质界面存在神经丛，角膜基质存在神经干，且均呈βIII-tubulin阳性。在感染后第10天角膜中神经的密度急剧下降，与正常角膜相比差异有统计学意义(P＜0.01)。小鼠角膜感染HSV-114天后，角膜基质内神经密度增加。HSV-1感染后28天，角膜中被βIII-tubulin染色的神经数目明显增多，与感染后第10天相比，差异存在统计学意义(P＜0.01)，染色的神经局限于角膜基质中，且伴有角膜敏感性完全丧失。感染28天后，感染的角膜基质出现一种“出芽生长”的神经纤维，交感神经标记物酪氨酸催化酶(TH)染色呈阳性。2.①免疫荧光染色的方法定位检测肾上腺素受体β2-AR在HSK小鼠角膜免疫细胞上的表达。CD4T细胞和巨噬细胞大多位于基质内。β2-AR在角膜上皮细胞、CD4T细胞和巨噬细胞均有表达。②流式细胞实验定量检测肾上腺素受体β2-AR在HSK小鼠角膜免疫细胞上的表达。HSK小鼠角膜中几乎所有的CD4T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞均表达β2-AR。第28天HSK角膜的CD45+细胞数目小于感染后第14天，差异有统计学意义(P＜0.01)且与临床评分结果一致。③感染后第5天给予HSK小鼠不同浓度β-AR受体阻断剂噻吗洛尔球结膜下注射治疗。感染后28天，实验组的角膜混浊度开始降低。直至感染后28天，角膜混浊程度明显下降，差异有统计学意义(P＜0.01)，但是角膜新生血管范围和角膜眨眼反射并无明显改善。流式细胞仪计数实验组和对照组角膜中的免疫细胞数目，CD4+T细胞和中性粒细胞数目实验组较对照组有显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。③浓度为100M去甲肾上腺素与CD3联合刺激作用于感染28天的小鼠脾脏原代细胞24小时后，该细胞IFN-γ表达阳性的CD4+T细胞比例为(7.86±0.65)%，高于CD3单纯刺激组,差异有统计学意义(P=0.043)；浓度为50M噻吗洛尔与CD3联合刺激作用于感染28天的小鼠脾脏原代细胞24小时后，该细胞IFN-γ表达阳性的CD4+T细胞比例为(4.26±±0.25)%，低于CD3单纯刺激组,差异有统计学意义(P=0.028)。
结论：
1.交感神经在HSK小鼠的角膜中呈过度生长并参与炎症过程。2.过度生长的交感神经通过生成去甲肾上腺素刺激β肾上腺素能受体激活炎症细胞从而促进角膜炎症；使用特异性β肾上腺素能受体阻断剂噻吗洛尔可以减轻小鼠HSK炎症反应。3.去甲肾上腺素在体外可促进HSK小鼠脾脏CD4+T细胞表达IFN-γ；噻吗洛尔则可抑制CD4+T细胞表达IFN-γ。
探讨交感神经在小鼠单纯疱疹病毒(HSV-1)性角膜炎病程进展中的重要作用以及交感神经过度生长在促进单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)炎症中的相关机制。
方法：
本研究选择HSV-1RE病毒株感染B6小鼠建立单纯疱疹病毒性角膜炎的小鼠模型。实验分以下两个部分进行研究：1.在感染后选取多个时间点对小鼠角膜情况进行临床评分并以照片和视频的方式记录保存。临床评分分为5个项目：眼睑皮肤病变，角膜浑浊程度，新生血管覆盖角膜的范围，角膜知觉测试，瞳孔大小。在HSV-1感染后采集小鼠角膜标本行免疫荧光染色。置于共聚焦显微镜下观察神经分布情况。2.①重新建立小鼠HSK模型，在感染后第14天和第28天收获角膜用CD4、F4/80及β2-肾上腺素受体(β2-AR)行免疫荧光染色，共聚焦显微镜扫描标本观察CD4+T细胞和巨噬细胞上的表情情况。在感染后第14天和第28天，将角膜细胞制成单细胞悬液，用CD45、CD4、F4/80、CD11b、Gr-1及β2-AR标记单细胞，流式细胞实验计数β2-AR表达阳性的免疫细胞。②HSV-1感染B6小鼠后用β2-AR受体拮抗剂噻吗洛尔和生理盐水分组进行球结膜下注射，临床评分估计HSK进展情况。治疗结束后行流式细胞实验计数CD4+T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，查看对照组和实验组免疫细胞数目变化。③将感染后第28天的小鼠脾脏细胞研磨并原代培养，加入浓度为100M的去甲肾上腺素或50M的噻吗洛尔刺激24小时后，采用流式细胞学实验方法检测CD4+T细胞上细胞内因子IFN-γ的表达情况。
结果：
1.①小鼠HSK病程进行临床评分的结果显示：HSV-1感染角膜后1-3天内角膜上皮出现点状、树状或地图状损伤。感染后7天出现角膜知觉下降。感染后15至20天被感染角膜表现为角膜混浊伴有溃疡、角膜知觉完全丧失以及全角膜范围的新生血管。角膜严重混浊、大范围新生血管及角膜知觉丧失都可持续至感染后至少70天(观察截止日期)②制备整个小鼠角膜标本行免疫荧光染色可见正常角膜的上皮/基质界面存在神经丛，角膜基质存在神经干，且均呈βIII-tubulin阳性。在感染后第10天角膜中神经的密度急剧下降，与正常角膜相比差异有统计学意义(P＜0.01)。小鼠角膜感染HSV-114天后，角膜基质内神经密度增加。HSV-1感染后28天，角膜中被βIII-tubulin染色的神经数目明显增多，与感染后第10天相比，差异存在统计学意义(P＜0.01)，染色的神经局限于角膜基质中，且伴有角膜敏感性完全丧失。感染28天后，感染的角膜基质出现一种“出芽生长”的神经纤维，交感神经标记物酪氨酸催化酶(TH)染色呈阳性。2.①免疫荧光染色的方法定位检测肾上腺素受体β2-AR在HSK小鼠角膜免疫细胞上的表达。CD4T细胞和巨噬细胞大多位于基质内。β2-AR在角膜上皮细胞、CD4T细胞和巨噬细胞均有表达。②流式细胞实验定量检测肾上腺素受体β2-AR在HSK小鼠角膜免疫细胞上的表达。HSK小鼠角膜中几乎所有的CD4T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞均表达β2-AR。第28天HSK角膜的CD45+细胞数目小于感染后第14天，差异有统计学意义(P＜0.01)且与临床评分结果一致。③感染后第5天给予HSK小鼠不同浓度β-AR受体阻断剂噻吗洛尔球结膜下注射治疗。感染后28天，实验组的角膜混浊度开始降低。直至感染后28天，角膜混浊程度明显下降，差异有统计学意义(P＜0.01)，但是角膜新生血管范围和角膜眨眼反射并无明显改善。流式细胞仪计数实验组和对照组角膜中的免疫细胞数目，CD4+T细胞和中性粒细胞数目实验组较对照组有显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。③浓度为100M去甲肾上腺素与CD3联合刺激作用于感染28天的小鼠脾脏原代细胞24小时后，该细胞IFN-γ表达阳性的CD4+T细胞比例为(7.86±0.65)%，高于CD3单纯刺激组,差异有统计学意义(P=0.043)；浓度为50M噻吗洛尔与CD3联合刺激作用于感染28天的小鼠脾脏原代细胞24小时后，该细胞IFN-γ表达阳性的CD4+T细胞比例为(4.26±±0.25)%，低于CD3单纯刺激组,差异有统计学意义(P=0.028)。
结论：
1.交感神经在HSK小鼠的角膜中呈过度生长并参与炎症过程。2.过度生长的交感神经通过生成去甲肾上腺素刺激β肾上腺素能受体激活炎症细胞从而促进角膜炎症；使用特异性β肾上腺素能受体阻断剂噻吗洛尔可以减轻小鼠HSK炎症反应。3.去甲肾上腺素在体外可促进HSK小鼠脾脏CD4+T细胞表达IFN-γ；噻吗洛尔则可抑制CD4+T细胞表达IFN-γ。