研究背景和目标肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势,严重威胁着人类的健康。在中国,由于存在较为严重的乙型肝炎病毒(HBV)感染等致癌风险因素,肝癌的发病率和死亡率态势尤为严峻。肝癌的治疗手段主要包括肝移植、肿瘤切除及非切除性局部疗法如肝动脉化疗栓塞等。由于肝癌特别是肝细胞肝癌(HCC)早期易发生转移以及治疗后易复发,系统化疗是临床上亟需的HCC治疗手段。靶向于酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase, RTK)的索拉菲尼(Sorafinib)是近年来在美国等多个国家批准应用于临床的第一个对HCC有效的系统化疗药物,是HCC分子靶向治疗研究进程中的一座里程碑。c-Met是RTK家族的典型成员之一,是当前抗肿瘤分子靶向药物研制的一个重要的靶点。然而,由于c-Met信号通路在HCC病理学状态下有诸多不明之处,以c-Met为靶点的抗HCC药物的研究与开发较为迟缓。我们课题组前期有关脱-Y-羧基凝血酶原(des-y-carboxy prothrombin, DCP)的基础研究发现DCP能够激活c-Met信号传导通路,对HCC细胞增殖和侵袭具有促进作用,可能在人HCC的发病和进展中发挥了重要的作用。在此基础上对HCC病理状态下c-Met信号通路传导机制的重新审视和进一步研究,将有助于更好地理解HCC的发病机制并推动抗HCC分子靶向药物研究与开发的进程。基质金属蛋白酶氨肽酶N (Aminopeptidase N,APN/CD13)在促进肿瘤的侵袭和转移中发挥了重要的作用,是当前抗肿瘤侵袭和转移药物研究中的重要靶酶之一。肿瘤细胞早期易发生转移以及由此导致的治疗后易复发是HCC最为显著的特点,因此控制肿瘤侵袭和转移在HCC的治疗中具有十分重要的意义。既往的研究表明,HCC细胞株APN/CD13表达水平较高,可能与其易发生转移的行为有关。因此APN/CD13抑制剂可能具有较好地控制HCC侵袭和转移的效果。肝脏是人体最大的实质性脏器,血供丰富,被认为是体内仅次于淋巴结的转移癌好发部位。卵巢癌肝转移后形成的继发性肝癌是临床常见的转移癌类型。当肝转移灶为多发性同时化疗又不敏感时,治疗将非常困难。因此,寻找新型的有效的卵巢癌治疗药物具有重要的意义。研究表明,APN/CD13在卵巢癌细胞有较高水平的表达,是抗卵巢癌药物研发的靶点之一。因此本课题的另一个目标是研究APN/CD13抑制剂抗HCC侵袭和转移的效果以及探讨该类抑制剂对易发生肝转移的卵巢癌的抗肿瘤效果和机制。第一章HCC病理状态下DCP/c-Met的表达及临床意义第一节.DCP在HCC组织中的表达特征和血清中的含量及其临床意义目的：测定DCP在人HCC组织中的表达特征和在血清中的含量并分析其与HCC临床病理学因素的关系,探讨DCP在人HCC演进过程中的促进作用。方法：选取92例行手术切除治疗的单发性HCC患者,收集并统计患者临床病理学因素包括年龄、性别、背景肝组织病毒感染和肝硬化状况、肿瘤病程进展、肿瘤分化程度、肿瘤体积、血管侵袭状况和肝内转移状况等。免疫组化法测定肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织中DCP的表达,酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定患者血清中DCP的含量。采用χ2检验分别分析肿瘤组织中DCP的表达和血清中DCP含量与临床病理学因素的相关性。采用Kaplan-Meier法计算术后患者的生存率,并以log-rank检验比较DCP血清含量高/低两组患者五年生存率的差异。以Cox风险回归模型分析影响患者术后生存的因素。结果：免疫组化研究结果显示73.9%的患者HCC组织中DCP的表达呈阳性。DCP在肿瘤组织中的表达与肿瘤的生长方式有关,浸润性生长或无包膜的肿瘤中DCP表达的阳性率显著高于膨胀性生长或有包膜的肿瘤,提示DCP的存在可能加重了肿瘤的恶性程度,促进了肿瘤细胞向周围非肿瘤组织的侵袭。ELISA检测结果显示44.6%的患者血清DCP的含量高于HCC诊断截断值0.0625AU/ml。HBsAg阳性、肿瘤中等分化程度、肿瘤存在血管侵袭和肝内转移、肿瘤病程处于III/IV期或肿瘤体积大于50mm时,患者血清中往往含有超过截断值的高水平的DCP含量。患者血清DCP的含量与术后生存期有关,血清中含有高水平DCP的患者五年生存率显著低于血清中含有低水平DCP的患者。结论：DCP在HCC患者血清和肿瘤组织中普遍存在,与多种病理学因素相关。DCP的表达与肿瘤具有较高的恶性程度相关。结合我们课题组前期有关DCP促进HCC增殖、侵袭和转移的实验结果,已有的证据提示DCP在HCC的演进中可能发挥了重要的促进作用。第二节.HCC组织中DCP与c-Met共表达及临床意义目的：探讨DCP和c-Met在人HCC组织中表达是否具有一致性及其临床意义方法：选取153例行手术切除治疗的单发性HCC患者,收集并统计患者临床病理学因素包括年龄、性别和术后HCC复发状况。免疫组化法分别测定肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织中DCP和c-Met表达状况。采用χ2检验分析组织中DCP和c-Met存在的相关性以及DCP/c-Met表达与HCC复发的关系。结果：DCP在肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织中的阳性表达率分别为63.4%(97/153)和13.1%(20/154),c-Met在肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织中的阳性表达率分别为66.7%(102/153)和28.8%(44/153)。DCP和c-Met在肿瘤组织中的阳性表达率均显著高于其在癌旁非肿瘤组织中的表达率。在肿瘤组织中,51%(78/153)的病例DCP和c-Met表达同时为阳性,20.9%(32/153)的病例二者的表达同时为阴性。在非肿瘤组织中,7.2%(11/153)的病例DCP和c-Met表达同时为阳性,65.4%(100/153)的病例二者的表达同时为阴性。在整个组织标本中,58.2%(89/153)的病例DCP和c-Met表达同时为阳性,19.6%(30/153)的病例二者的表达同时为阴性。χ2检验表明DCP和c-Met在HCC标本中的存在具有相关性。c-Met在肿瘤组织中的表达与术后HCC复发有关。c-Met结合DCP比c-Met单独对预测术后HCC复发的意义更显著。c-Met和DCP在HCC标本中的表达均为阴性时,该组病人术后复发率低于c-Met或DCP表达为阴性的各组患者的复发率。结论：c-Met和DCP在HCC组织中的表达具有广泛性和一致性,与HCC术后高复发率有关。当二者表达均为阴性时,HCC患者术后复发率较低。第二章c-Met抑制剂抗HCC效果及机制研究目的：探讨c-Met激酶小分子抑制剂SU11274对HCC细胞增殖的抑制作用。方法：选用高分化型HCC细胞株HepG2和HuH-7及低分化型HCC细胞株HLE, MTT法分别测定：①DCP对三种细胞增殖的刺激作用；②c-Met激酶抑制剂SU11274对三种细胞增殖的抑制作用；③同时加入DCP和SU11274对三种细胞增殖的影响。Western blot法测定SU11274对HepG2、HuH-7和HLE细胞c-Met、磷酸化c-Met和磷酸化ERK水平的影响。结果：c-Met激酶特异性小分子抑制剂SU11274具有抑制HCC细胞生长增殖的活性。其对分化性高的细胞株HepG2(?)口HuH7以及分化性低的细胞株HLE增殖的半数抑制浓度类似,均在6-9μM范围内。DCP对肝癌细胞株的增殖有不同程度的刺激作用。SU11274能够抑制或抵消DCP促进HCC细胞生长增殖的生物学作用。SU11274能够降低细胞磷酸化c-Met、磷酸化ERK的水平,从而抑制c-Met信号通路的传导。结论：c-Met激酶小分子抑制剂SU11274能够显著地抑制HCC细胞生长增殖,并能对抗或抵消DCP促进HCC细胞增殖的作用。抑制c-Met激酶活性可能是抗HCC药物研究与开发的合理策略,该类抑制剂可能对表达DCP的HCC更有效。第三章APN/CD13抑制剂抗肿瘤效果及机制研究第一节.APN/CD13抑制剂抗HCC侵袭及新血管生成研究目的：探讨APN/CD13抑制剂24F对HCC细胞侵袭和新血管生成的抑制作用方法：选用人HCC细胞HuH-7和人脐静脉血管内皮细胞HUVEC,二者均表达APN/CD13。以L-亮氨酸对硝基苯胺为底物测定24F对APN/CD13酶活性的抑制作用。MTT法测定24F对HuH-7细胞增殖的抑制作用。Transwell细胞侵袭实验测定24F对HuH-7细胞侵袭和游走运动能力的抑制作用。微管形成实验测定24F对HUVEC细胞在Matrigel表面形成微管样结构的抑制作用。结果：化合物24F对APN/CD13酶活性的半数抑制浓度为1.88mM。24F在0-200μg/mL浓度范围内对HuH-7细胞的增殖具有轻微地抑制作用,未观察到该化合物对HuH-7有明显的细胞毒效应。体外细胞侵袭实验结果表明,24F能够减少穿过Matrigel的HuH-7细胞数目,显示其对肿瘤细胞侵袭和游走运动能力的抑制作用。24F能够在体外抑制血管内皮细胞HUVEC形成微管样结构,提示24F具有潜在的抑制肿瘤新血管生成的能力。结论：APN/CD13抑制剂24F对HCC细胞侵袭和游走运动能力具有抑制作用,对血管内皮细胞HUVEC微管形成具有抑制作用,提示APN/CD13抑制剂在抗HCC侵袭转移及新血管生成方面具有潜在的应用价值。第二节.APN/CD13抑制剂抗卵巢癌增殖及新血管生成研究目的：探讨APN/CD13抑制剂LYP对卵巢癌生长增殖及新血管生成的抑制作用。方法：体外实验选用人卵巢癌细胞株ES-2和SKOV-3以及人脐静脉血管内皮细胞HUVEC。三种细胞均表达APN/CD13,表达水平由高到低依次为ES2、 SKOV-3和HUVEC。MTT实验测定LYP对细胞增殖的抑制作用。台盼蓝实验检测LYP的细胞毒效应。以L-亮氨酸对硝基苯胺为底物测定LYP对APN/CD13酶活性的抑制作用。流式细胞术和Western blot实验分别测定LYP对细胞APN/CD13表达水平的影响。划痕实验和Transwell侵袭实验观察LYP对HUVEC细胞侵袭和游走运动能力的抑制作用。微管形成实验测定LYP对HUVEC细胞在Matrigel表面形成微管结构的抑制作用。裸鼠接种ES-2细胞后尾静脉给予LYP治疗两周,观察药物对ES-2肿瘤生长的抑制作用和裸鼠对给药方案的耐受性。CD34免疫组化实验测定LYP对ES-2肿瘤组织平均血管密度和平均血管直径的影响。Western blot实验测定LYP对肿瘤组织内APN/CD13、VEGF、bFGF和TGFa表达水平的影响。结果：MTT实验结果表明LYP能够有效的抑制ES-2细胞的增殖。LYP对ES-2细胞APN/CD13酶的活性具有显著的抑制作用。相同浓度下,LYP对APN/CD13酶活性的抑制作用大于乌苯美司。相对于ES-2细胞,LYP对SKOV-3细胞增殖的抑制作用较弱,提示LYP对ES-2细胞增殖的抑制作用可能与抑制APN/CD13有关。流式细胞术实验和Western blot实验表明LYP能够降低体外培养ES-2细胞APN/CD13的表达水平。裸鼠接种ES-2细胞后尾静脉给予LYP,连续治疗两周,ES-2肿瘤的生长受到显著的抑制作用。Western blot实验结果显示LYP能够降低肿瘤组织APN/CD13的含量。与阳性对照药乌苯美司相比,LYP对ES-2肿瘤生长的抑制作用较强。裸鼠对给药方案的耐受性良好,给药组裸鼠的体重与阴性对照组比较没有显著性差异。为进一步研究LYP抑制体内ES-2肿瘤生长作用背后的机制,我们检测了LYP在抑制新血管生成方面的药理活性。MTT实验和台盼蓝实验结果显示在5-80μM浓度范围内,LYP对HUVEC细胞没有明显的细胞毒效应。在该浓度范围内LYP对HUVEC细胞APN/CD13酶的活性有一定的抑制作用。Transwell侵袭实验和划痕实验结果显示LYP能够明显抑制HUVEC细胞的侵袭和游走运动能力。微管形成实验表明LYP对HUVEC细胞在Matrigel表面形成微管样结构具有抑制作用。LYP对新血管生成的抑制作用在体内实验中得到了验证。对ES-2肿瘤组织进行CD34免疫染色,结果发现LYP给药组肿瘤平均血管密度和平均血管直径均小于阴性对照组。在相同给药剂量下,LYP抑制新血管生成的作用大于阳性对照药乌苯美司。LYP的抗微血管生成作用可能与其抑制与血管生成有关的分子的表达有关。Western blot实验结果显示,LYP给药组肿瘤组织内VEGF、bFGF和TGF-a的水平显著低于阴性对照组。结论：LYP在体外和体内对卵巢癌细胞生长增殖具有较强的抑制作用,该作用可能与其降低细胞APN/CD13表达水平和抑制新血管生成有关。