L-谷氨酰胺(以下简称L-Gln)是L-谷氨酸的r-羟基酰化的一种氨基酸,它是生物体合成蛋白质的基本氨基酸之一。在人体内,L-Gln约占游离氨基酸的一半以上,是人类机体中含量最丰富的氨基酸,也是目前所知的最重要的氨基酸之一。L-Gln的应用十分广泛,尤其在医药领域具有十分重要的作用[1]。近年来临床研究进展预示:L-Gln在未来临床上的价值和用途将可能超过维生素C。参考欧美市场L-Gln的销售趋势,保守估计我国L-Gln原料药需求量每年可达5000吨以上[2]。目前,我国是世界上L-谷氨酸最大的消费国和生产国,然而在对作为谷氨酸结构类似物的L-Gln的发酵法生产方面的研究,从本世纪八十年代才有所报道,但与国外先进工艺水平仍还有较大差距。因此,医用级L-Gln一直以来依靠国外进口[3]。现在国际市场上L-Gln价格约在100万元/吨,其生产成本大约为谷氨酸的3-4倍。随着人类医疗健康水平的进步、财富的积累和人们对L-Gln作用机理研究的不断深入,L-Gln的作用和功能将会得到更大限度的开发。正如上所述,L-Gln是人体的一个重要条件必需氨基酸,在医学与食品界都有潜在的需求。我们首次应用小泛素相关的修饰(SUMO)融合技术到枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶的表达与纯化上。SUMO化修饰能够帮助蛋白正确折叠,有助于提高重组谷氨酰胺合成酶的活性与可溶性。这样,再通过我们实验室建立的细菌谷氨酰胺合成酶与酵母酒精发酵偶联生产体系,解决了传统酶法生产谷氨酰胺过程中成本高、效率低的问题,实现了酶法高效生产谷氨酰胺的可行性。为了使获得的谷氨酰胺合成酶有较高的谷氨酰胺生成活性,并考虑到在食品与药学工业生产上的安全性与低成本,本研究选用0.1%的乳糖作为表达诱导剂。通过SDS聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)与蛋白实验室印记分析实验,验证了融合蛋白在大肠杆菌中表达是完全可溶性的。融合蛋白纯化达到90%的纯度,通过次氮基三乙酸镍柱(Ni2+-NTA)色层分析,每升发酵培养液中有625毫克的产量。SUMO融合的谷氨酰胺合成酶通过SUMO蛋白酶切除SUMO蛋白,切割后的样品重新用Ni-NTA柱纯化。最后,每升发酵培养液中有121毫克纯度达到96%的重组的谷氨酰胺合成酶。重组纯化的谷氨酰胺合成酶有很强的活性,每毫克达到23U。在50毫升反应系统中用25U的重组谷氨酰胺合成酶,通过高效液相色谱仪与薄层分析显示,L-Gln生物合成产量达到27.5 g/l。由此我们可以看到,SUMO介导的谷氨酰胺合成酶的表达与纯化系统能潜在被应用于工业L-Gln的生产上。