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食管癌(EC)是临床上常见的一类消化系统恶性肿瘤。高通量检测发现多种微小RNA (miRNA)在正常组织与肿瘤组织中的表达水平具有明显的差异，参与了食管癌的发生发展进程。miR-27与多种肿瘤的发生密切相关，但尚无miR-27在食管鳞状细胞癌(ESCC)发生发展中作用的报道。本研究首先检测miR-27a与食管鳞状细胞癌的相关性，然后预测并验证miR-27a可通过其靶基因KRAS基因调控Ras/Raf/MEK/ERK信号通路，表明miR-27a表达降低促进食管鳞状细胞癌的增殖和转移，为食管鳞状细胞癌提供了新的可能的治疗靶点。第一部分：miR-27a在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义研究方法1.在基因表达数据库(GEO)中检索食管鳞状细胞癌的miRNA芯片数据并进行分析。对44例食管鳞状细胞癌和32例食管腺癌中癌组织和癌周正常组织中miR-27a和miR-27b的表达量进行分析。2.采用RT-PCR检测25例确诊食管鳞状细胞癌并伴有淋巴结转移患者的癌组织及其配对癌周正常组织中miR-27a的表达。3.采用RT-PCR检测6种食管鳞状细胞癌细胞系及正常食管上皮细胞中miR-27a的表达。结果1.检索GEO数据库，发现在伴有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌病例中，miR-27a的表达显著下调(n=20, p=0.041)，而miR-27b改变不明显(n=24, p=0.785)。在32例食管腺癌中，无论有无淋巴结转移，miR-27a或miR-27b表达较癌周正常组织均无显著差异。2.在确诊食管鳞状细胞癌并伴有淋巴结转移患者的癌组织中miR-27a的表达显著低于癌周正常组织。3.6种食管鳞状细胞癌细胞系中miR-27a表达较正常食管上皮细胞均显著降低，其中TE-1细胞中miR-27a表达最低。结论miR-27a在伴有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌组织中表达降低，且在6种食管鳞状细胞癌细胞系中均表达降低，表明miR-27a可能参与食管鳞状细胞癌的发生和转移过程。第二部分：miR-27a在食管鳞状细胞癌组织、细胞中靶基因的研究研究方法1.采用TargetScan靶基因预测软件，预测miR-27a可能靶向KRAS基因。2.构建KRAS基因3’-UTR片段双荧光素酶报告载体(野生型和突变型)，分别与miR-27a或Scramble质粒共转染HEK293细胞，检测荧光值。3.在TE-1细胞中转染miR-27a前体、miR-27a抑制剂及其各自对照，分别采用RT-PCR和Western blot检测KRAS mRNA和KRAS蛋白的表达变化。4.通过RT-PCR对25例确诊食管鳞状细胞癌并伴有淋巴结转移的患者癌组织进行miR-27a检测，并通过western blot检测KRAS蛋白的表达。结果1. KRAS基因3’-UTR有两个序列片段可能与miR-27a结合，分别是343-349和4583-4589位点。2.双荧光素酶实验证明：在转染野生型片段的细胞中，miR-27a高表达显著抑制荧光素表达；当将结合位点突变后，上述抑制作用丧失。3. miR-27a高表达抑制KRAS基因mRNA和蛋白表达，而抑制miR-27a可促进KRAS基因mRNA和KRAS蛋白表达。4.25例确诊食管鳞状细胞癌并伴有淋巴结转移的患者癌组织中miR-27a与KRAS基因mRNA和KRAS蛋白水平均呈负相关。结论miR-27a可靶向抑制食管鳞状细胞癌细胞KRAS基因的表达，并在伴有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌组织中miR-27a与KRAS基因mRNA和蛋白表达均呈负相关，miR-27a的低表达与KRAS激活相关。第三部分：TE-1细胞中miR-27a靶向KRAS基因的作用机制研究方法1.在TE-1细胞中单独或共转染miR-27a和KRAS，RT-PCR和Western blot检测miR-27a、KRAS、磷酸化ERK及c-Fos表达。2.在TE-1细胞中单独或共转染miR-27a和KRAS，MTT法检测细胞增殖。3.在TE-1细胞中转染miR-27a及其抑制剂，划痕实验检测细胞侵袭能力的改变。4.稳转miR-27a和miR-27a抑制剂的TE-1细胞，进行裸鼠成瘤实验，分别在10天、15天、20天、25天测量肿瘤体积，30天后分离瘤体测体积并称瘤重。结果1.在TE-1细胞中高表达miR-27a可抑制ERK磷酸化及其下游c-Fos的表达；抑制miR-27a可促进ERK磷酸化及其下游c-Fos的表达。共转染miR-27a和KRAS，外源性KRAS的表达减弱miR-27a对ERK的磷酸化。2.高表达miR-27a可抑制TE-1细胞增殖，抑制miR-27a可促进TE-1细胞增殖。而高表达KRAS，可逆转此现象。3.高表达miR-27a导致TE-1细胞对划痕修复能力减弱，而抑制miR-27a可使划痕修复增强。而共转染KRAS，可逆转miR-27a高表达对细胞迁移的抑制。4.裸鼠成瘤实验显示miR-27a高表达显著抑制肿瘤生长，而抑制miR-27a可显著促进肿瘤生长。结论miR-27a作为潜在的抑癌基因，可通过其靶基因KRAS调控下游Ras/Raf/MEK/ERK信号通路，抑制肿瘤的增殖和侵袭；食管鳞状细胞癌细胞中miR-27a表达降低可能是肿瘤发生和转移的机制之一。