毒理学是研究化学物质对生物体的毒性反应及其严重程度、发生频率和毒性作用机制,也是对毒性作用进行定性和定量评价的一门学科。体外细胞实验等生物技术由于其高通量、高精度、快速以及平行性的特点,已成为生物医学研究领域中的一项先进实用的技术,具有很高的应用价值。毒理学的研究必定要深入到细胞及分子水平。中药(尤其是其复方制剂)成分复杂,应用传统方法评价中药的遗传毒性十分困难,而借助现代细胞学技术,从细胞水平上对药物在体外进行准确、快速、高效的安全性评价,使得我们能从微观角度更好地了解中药遗传毒性的作用靶点及其作用机制。星形神经胶质细胞(astrocyte,AS),作为神经系统中起营养、支持及保护神经元作用的一类细胞,由于其敏感性高,更易受到毒性物质的损伤。许多证据表明,星形神经胶质细胞在许多神经退行性疾病中有十分重要的作用。迄今为止,有关星形神经胶质细胞毒性的研究尚未见到报道。香茶菜属植物几乎遍布我国各地,并且种类繁多,约有30种原植物在民间作药用,具有清热解毒、活血化淤、抗菌消炎、抗肿瘤、治疗肝炎等各种功效。在药用香茶菜中,二萜类化合物含量丰富,是其主要的活性成分。其中C-20-未氧化-对映-贝壳杉烯型二萜化合物是生物活性最强的一类,Leukamenin E即为其中的一种。本论文进行了Wistar大鼠星形神经胶质细胞的纯化培养,以对映-贝壳杉烯二萜化合物Leukamenin E为受试药物,通过SRB检测、台盼蓝排染、彗星电泳、吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染、细胞形态的观察及核染色质形态观察等方法,初步研究了该化合物对星形神经胶质细胞生长的影响以及其作用机制,以期为Leukamenin E的进一步合理应用提供科学依据。结果如下:(1)成功培养了AS并对其进行了纯化。实验通过组织消化、限制性培养以及摇床震荡等方法,得到了纯度高、状态良好的AS培养物。原代培养的AS在接种后2-3d完成贴壁,9-12d即可铺满培养瓶底。初级培养物含有包括小胶质细胞、成纤维细胞、少量神经元在内的多种细胞,通过限制性培养降低这些细胞的含量,而神经元逐渐退化,最终死亡;摇床震荡利用细胞差速贴壁的原理,除去杂细胞,最终得到纯度较高的AS培养物。(2)SRB法及台盼蓝排染法检测细胞毒性结果显示,Leukamenin E对AS有很强的细胞毒性,在0.625μM以及1.25μM的低浓度作用下对细胞具有显著的生长抑制效应,而在5μM以及10μM的高浓度作用时能致细胞死亡。生长抑制效应和致死效应都具有显著的时间、剂量依赖性。(3)倒置显微镜形态观察及吉姆萨染色显示,Leukamenin E作用可以引起细胞形态的显著改变,并且有明显的时间、剂量效应。吉姆萨染色实验中,随化合物浓度的增加(1.25μM、2.5μM),细胞膜表面微绒毛不清晰甚至消失,细胞核染色质凝集,在高浓度药物(5μM)作用下,观察到核碎裂。(4)彗星电泳实验结果显示,化合物Leukamenin E可以引起AS DNA的损伤,并具有时间-剂量效应。随着化合物作用浓度的增加以及作用时间的延长,损伤细胞——彗星样细胞增多、损伤率显著增加,Olive尾矩(OTM)、尾长(TL)、尾部DNA的量(TDNA)也明显增加,并且细胞的损伤等级也随之升高。(5) Hoechst 33258荧光染色以及AO/EB双染实验结果显示,Leukamenin E作用使细胞表现出明显的凋亡性特征,这说明Leukamenin E主要通过凋亡的方式引起星形神经胶质细胞的死亡,并且具有显著的时间-剂量效应。