背景和目的:乳腺癌目前是女性患者第一好发的肿瘤,虽然早期诊断其治疗效果好,但是一旦发生转移后其预后效果比较差。骨是乳腺癌细胞最容易发生转移的部位,乳腺癌转移至骨后会并发诸如高钙血症、病理性骨折、神经及脊髓的压迫等,严重的影响患者的生存质量及时间。有研究发现转移至骨的乳腺癌细胞会发生骨拟态的改变,即在骨转移灶中乳腺癌细胞会模拟成骨细胞的表型,并且能够分泌成骨细胞所特异分泌的蛋白及因子。这种特性可以让转移至骨的肿瘤细胞去逃避免疫系统的识别使其在骨微环境中快速的增殖,肿瘤细胞的这种特性可能成为研究肿瘤骨转移的新突破口。肿瘤细胞在骨转移灶中把自己伪装成成骨细胞,那么成骨细胞在肿瘤细胞骨拟态中起到了什么样的作用,目前尚不清楚。成骨细胞能够特异性分泌骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG),而这几种特异性蛋白均在肿瘤细胞骨转移过程中起到重要作用。目前已经证实OCN的表达在乳腺癌患者的血清中明显增高,OPG的表达与肿瘤细胞的克隆及归巢密切相关,OPN的表达量增高有利于肿瘤细胞的增殖及侵袭。有学者将成骨细胞与前列腺癌细胞共培养后发现前列腺癌细胞能够发生骨拟态的改变。本实验第一部分假设如果转移至骨的肿瘤细胞的骨拟态是由成骨细胞引起的,那么成骨细胞也能够促使溶骨型的乳腺癌细胞发生骨拟态的改变并且能够高表达OPN、OPG、OCN等成骨细胞骨特异性分泌且与肿瘤细胞转移及增殖密切相关的蛋白。其次,众所周知,肿瘤细胞在骨微环境中的生长与骨质破坏后释放的肿瘤生长因子息息相关,但有研究表明,双磷酸盐能够通过抑制破骨细胞分化、成熟,从而很好的抑制乳腺癌骨转移灶的骨质破坏并间接的影响肿瘤生长因子的释放,但是却不能抑制肿瘤的生长,这说明除了骨质破坏后释放的大量生长因子刺激肿瘤细胞增殖外,肿瘤细胞一定有其它的增殖途径。本课题通过将成骨细胞与溶骨型乳腺癌细胞共培养,研究成骨细胞在乳腺癌细胞发生骨拟态以及肿瘤细胞增殖中的作用。为深入研究肿瘤细胞骨拟态及增殖的机制奠定基础。方法:1.通过transwell小室建立成骨细胞MC3T3-E1与乳腺癌MDA-MB-231细胞共培养体系,模拟骨微环境。通过实时免疫荧光定量PCR及蛋白免疫印迹实验检测共培养后的MDA-MB-231细胞成骨相关基因及蛋白OCN、OPN、OPG的表达量,并与未共培养的MDA-MB-231细胞相比,以此确定乳腺癌MDA-MB-231细胞是否发生了骨拟态的改变。2.通过结晶紫染色法观察与成骨细胞MC3T3-E1共培养后的乳腺癌细胞在集落形成速度及大小上与未和成骨前体细胞MC3T3-E1共培养的差别。3.通过CCK-8检测与成骨前体细胞MC3T3-E1共培养后的MDA-MB-231乳腺癌细胞与亲代MDA-MB-231细胞在细胞增殖方面的差异。4.通过PCR检测与成骨细胞共培养后的乳腺癌细胞Wnt-1及Wnt-2的基因表达水平。结果:1.将与MC3T3-E1成骨前体细胞共培养后的实验组MDA-MB-231乳腺癌细胞与未和MC3T3-E1成骨前体细胞共培养的对照组相比,实验组中OCN、OPN、OPG的m RNA及蛋白表达明显的高于对照组(p<0.05)。2.通过结晶紫染色法将与MC3T3-E1成骨前体细胞共培养后的实验组MDA-MB-231乳腺癌细胞与未和MC3T3-E1成骨前体细胞共培养的对照组相比,实验组在集落形成数量及大小上明显优于对照组(p<0.05)。3.CCK-8实验表明在0及24h时实验组与对照组的细胞增殖差异不明显,但在48及72h时实验组的细胞增殖能力较对照组有明显的提高。4.PCR结果提示,与成骨前体细胞共培养后的实验组MDA-MB-231乳腺癌细胞与未和MC3T3-E1成骨前体细胞共培养的对照组相比,实验组乳腺癌细胞的Wnt-1及Wnt-2的m RNA表达明显上调(p<0.05)。结论:1.成骨细胞MC3T3-E1可诱导溶骨型乳腺癌MDA-MB-231细胞发生骨拟态的改变。2.成骨细胞MC3T3-E1能够增强乳腺癌MDA-MB-231细胞的集落形成能力,且能够促进其增殖,并且MC3T3-E1能够诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞上调Wnt-1及Wnt-2的m RNA表达。