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脂蛋白脂肪酶(lipoproteinlipase,LPL)是血浆脂蛋白代谢的关键酶,其可将乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯水解为甘油和游离脂肪酸供组织利用。载脂蛋白CⅡ(ApolipoproteinCⅡ,ApoCⅡ)作为脂蛋白脂肪酶的必需激活因子,可激活LPL,在脂类代谢中发挥着重要作用。ApoCⅡ结构、水平、功能异常和LPL基因变异会使脂蛋白脂肪酶(LPL)活性降低,导致脂蛋白代谢紊乱,发生异常脂蛋白血症。异常脂蛋白血症是最常见的代谢性疾病之一,也是动脉粥样硬化的重要危险因子。
本实验分为两部分,第一部分为探讨中国人群LPL基因常见突变的种类、频率以及其可能产生的影响,我们利用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析技术对203例人群LPL基因转录起始位点上游140bp以内的调节区和外显子4(包括内含子-外显子交界区)进行了突变的筛查。在203例样品中检出1例发生在外显子4扩增区域的可疑突变,通过PCR产物直接测序,证实为内含子3受位剪接位点上游6bp的C→T转换突变杂合子,未检出其他突变。目前该突变仅发现于日本和中国,尚未读到其他国家的相关报告。结合国内外相关文献和分子流行病学调查,以及关于突变基因结构和作用机制的讨论,显示该突变可能是中国人高甘油三酯血症的遗传易患因素之一。与以往国内外报道该突变仅见于高甘油三酯血症患者不同,本次在一名血脂正常人员检出LPL基因内含子3C→T突变,对探讨该突变的可能影响具有一定的参考价值。
第二部分为小鼠载脂蛋白CⅡ的克隆和表达。首先从小鼠肝组织提取总RNA,采用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增获得小鼠ApoCⅡ基因编码序列,将小鼠载脂蛋白CⅡ编码基因片段重组入质粒pUC18,得到重组克隆载体pUC18-mouseApoCⅡ(pUC18-mApoCⅡ),并进行DNA序列测定。在此基础上,自pUC18-mApoCⅡ酶切ApoCⅡ基因编码序列的DNA片段,重组入融合表达载体pGEX-3X,得到pGEX-mouseApoCⅡ(pGEX-mApoCⅡ)重组表达载体,并进行序列测定。测序证实重组质粒pUC18-mApoCⅡ及pGEX-mApoCⅡ的中的ApoCⅡ编码片段的序列与GenBank中的一致。在大肠杆菌DH5α中,经IPTG诱导表达、亲和层析纯化后获得了融合蛋白GST-mApoCⅡ,SDS-PAGE和WesternBlotting检测证明融合蛋白与我们所预期的目的蛋白分子量接近,并且融合蛋白具有免疫原活性。该实验成功构建了含编码小鼠ApoCⅡ基因的重组克隆载体pUC18-mApoCⅡ和原核表达载体pGEX-mApoCⅡ,并进行了诱导表达。选用pGEX-3X质粒作为表达载体是因为其可诱导高效表达,所表达的融合蛋白既可减少宿主菌蛋白酶的水解作用又纯化方便,并且通过表达出融合蛋白轻而易举的解决了ApoCⅡ分子量小,抗原性弱的问题,为以后基因工程生产有生物活性的ApoCⅡ,开展ApoCⅡ的免疫学测定及进一步探讨ApoCⅡ治疗高甘油三酯血症的可能性奠定了基础。