本研究隶属于吉林省科技发展计划项目《高底物浓度条件下酶解蛋清蛋白工艺研究》（20200801030GH）。蛋清蛋白是一种营养价值高且来源丰富的优质蛋白,其酶解产物蛋清肽具有更好的生物活性,且更易被人体吸收,生物利用率更高。研究发现蛋白的酶解产物（肽）的消化吸收特性与其分子量分布和组成密切相关,而酶解肽分子量与组成的变化与蛋白酶解过程有关。本论文以蛋清蛋白及水解物为研究对象,分别在胰蛋白酶和碱性蛋白酶酶解体系中探究了不同底物浓度对蛋清蛋白酶解产物的影响,测定对比了酶解产物中肽分子量及氨基酸序列组成的差别;明确在不同底物浓度下,酶解产物性质的差异。并以酶解效率更高的碱性蛋白酶体系为模型,对比了不同底物浓度下酶解产物（肽）的氨基酸吸收速率差异;在此基础上比较了合成的4条二肽的氨基酸补充速率,并筛选出补充甲硫氨酸效果最好的一条二肽,利用分子对接和动力学模拟探究了二肽与转运蛋白Pep T1之间的分子作用,进一步明确了蛋清小肽作为氨基酸快速补充剂的潜力。全文主要研究内容及结果如下:（1）探究底物浓度对胰蛋白酶酶解产物组成的影响。结果表明:2%底物浓度下的水解度（4.879±0.241%）显著高于9%浓度下的水解度（3.472±0.190%）;不同底物浓度下酶解得到的肽分子量分布不同,9%浓度下得到的酶解产物中小分子肽（＜1 k Da）的含量最低（25.82%）,与其他底物浓度下的酶解产物相比,其含量分别降低了11.98%、12.45%和16.99%。同时,不同底物浓度下酶解产物中肽数量、序列和氨基酸组成也有差别。在高（9%）、低（3%）底物浓度下分别鉴定出69条肽和72条肽,其中仅有57条肽序列是相同的。对比发现酶解肽的来源占比和N端氨基酸组成略有不同。结合酶活性和构象的测定结果,发现在不同底物浓度下（3%、5%、7%和9%）虽然酶活性没有显著差异,但蛋白酶构象些微的变化可能会影响其酶切偏好,造成酶解产物中肽序列的差异。（2）探究底物浓度对碱性蛋白酶酶解产物中肽的组成及氨基酸补充速率的影响。结果表明:不同底物浓度会导致酶解产物中肽组成发生改变,还会影响酶解产物的氨基酸补充速率。LC-MS/MS数据表明,酶解6h时,Lsc-hydrolysates中检测到45个肽段,而Hsc-hydrolysates中检测到61个肽段,两种底物浓度下的37个肽段具有一致性,其主要蛋白来源也相同。但在两种底物浓度下不同氨基酸在肽段C末端出现的频率不同,在底物浓度低时C端氨基酸为亮氨酸的比例最大,而在底物浓度高时为苯丙氨酸,说明该酶在两种底物浓度下对酶切偏好存在差异。动物实验结果表明,不同底物浓度下酶解产物的氨基酸补充速率不同。给ICR小鼠灌胃Lsc-hydrolysates后,小鼠血清中大部分氨基酸含量高于Hsc-hydrolysates组（除三种非必须氨基酸天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺外）。灌胃0.5 h时,Lsc-hydrolysates对三种必需氨基酸（甲硫氨酸、异亮氨酸和亮氨酸）的补充速率显著高于Hsc-hydrolysates。结合不同底物浓度下酶活性及构象变化情况,尝试解释了导致不同底物浓度下酶解产物存在差异的原因,这可能是由于不同底物浓度下蛋白质和肽分子在体系中的扩散速度不同,从而影响其与酶的结合和反应。（3）探究二肽的氨基酸补充速率差异及与Pep T1相互作用机制。通过给ICR小鼠分别灌胃二肽（MM、EM、KM和GM）和甲硫氨酸,考察不同组别小鼠血清中甲硫氨酸含量差异。结果表明,MM组所采集的血清中甲硫氨酸含量最高,表现出的吸收速率最快,为84.748±18.659 mg/L;EM次之,为78.257±23.378 mg/L;而KM和GM表现出较慢的吸收速率,分别为58.247±14.081 mg/L和55.003±8.960 mg/L。利用分子对接和动力学模拟考察了四种二肽与Pep T1蛋白的结合能力和分子互作机制。MM、EM、KM和GM与Pep T1蛋白之间的结合自由能分别为:MM,-5.15 kcal/mol;EM,-4.85 kcal/mol;KM,为-6.35 kcal/mol;GM,为-4.47 kcal/mol。通过分子动力学对二肽与Pep T1复合物进行分析,发现MM和EM与Pep T1蛋白之间形成稳定复合物的速度更快,结合过程中容易形成稳定氢键。分子对接结果和分子动力学模拟结果表明MM的转运过程中,与Pep T1蛋白的Arg25,Tyr29,Tyr291,Asn329和Glu402残基间有较强的氢键作用,EM分别与Pep T1蛋白的Ala341、Ala358、Lys359、Phe360、Leu404和Ser406残基间形成稳定氢键。