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本研究在王彦平构建的植物表达载体基础上构建Bt抗虫基因表达载体,并转化烟草,对Bt基因表达水平进行检测。试验进一步以普通741杨和转双抗虫基因pB29无菌苗为试验材料,建立了叶片再生体系并对农杆菌介导的遗传转化体系进行了优化。通过农杆菌介导法将Bt cry3A (Bt3)基因转入已含Bt cry1A(c) (Bt1)基因的pB29中,获得转双Bt基因741毛白杨,对部分转化植株进行了DNA水平和蛋白质水平的检测。主要研究结果如下:利用植物表达载体pCAMBIA1305-Bt1-Bt3、pCAMBIA1305-Bt1和pCAMBIA1305-Bt3,通过DNA重组技术,分别将Bt1和Bt3基因正向插入植物表达载体pCAMBIA3301中,成功构建了pCAMBIA3301-Bt1、pCAMBIA3301-Bt3植物表达载体。此可读框架通过组成型启动子CaMV35S启动,携带PPT乙酰基转移酶(PAT)基因作为选择标记基因,并将构建的表达载体导入根癌农杆菌EHA105。确定烟草转化的潮霉素临界筛选浓度为50 mg.L-l,头孢噻肟钠的抑菌浓度为200 mg.L-l。采用农杆菌介导法,将植物表达载体载体pCAMBIA1305-Bt1-Bt3、pCAMBIA1305-Bt1和pCAMBIA1305-Bt3及构建的植物表达载体pCAMBIA3301-Bt1、pCAMBIA3301-Bt3转入烟草中,均得到完整再生植株。经PCR检测,初步证明目的基因已整合到烟草的基因组中。ELISA检测表明,大部分转基因株系中Bt1和Bt3毒蛋白表达量均高于对照。在5株携带双价Bt基因的转基因烟草中,Bt1毒蛋白和Bt3毒蛋白的表达量最高分别达0.030 1%和0.293 8%。对农杆菌介导的741杨遗传转化体系进行了优化,确定叶片诱导分化不定芽的适宜培养基为MS+ 6-BA 1.0 mg.L-l + NAA 0.1 mg.L-l,生根培养基为1/2 MS+ NAA 0.1 mg.L-l。潮霉素临界筛选浓度为10 mg.L-l,抗生素头孢噻肟钠的抑菌浓度为400 mg.L-l。遗传转化的适宜菌液浓度为OD600 = 0.4,浸菌时间为8~10 min,共培养时间以2 d为宜。采用农杆菌介导法,将Bt3基因转入已转Bt1基因的杂种741毛白杨无性系pB29中,获得转双Bt基因741毛白杨。在含Hyg的培养基中进行多次继代筛选,获得抗性稳定的无性系9个,编号为pC1~pC9。采用特异引物分别对获得的转双Bt基因741杨无性系进行PCR检测,结果表明:Bt1基因稳定存在于pB29无性系中,Bt3基因已整合到各无性系的基因组DNA中。对杂种741毛白杨转化植株进行毒蛋白表达的ELISA检测,结果表明,所选转双价Bt基因的741杨的2个无性系pC1和pC2,均检测到Bt1和Bt3毒蛋白的表达。Bt1毒蛋白的表达量分别为0.009 4%和0.011 0%;Bt3毒蛋白的表达量分别为0.217 0%和0.149 4%,高于对照pB29及转单一Bt3基因的741杨无性系CC71的Bt3蛋白表达量(0.033 7%)。