I黄酮类化合物对药物转运体BCRP的调控及分子机制黄酮类化合物是一类广泛分布于蔬菜、水果和中草药中的天然产物,具有抗肿瘤,免疫调节,抗炎,抗氧化等众多药理活性。研究报道,黄酮的摄入能促进身体健康,降低癌症和神经退行性疾病发生的风险,但与临床药物合用时也可能引起药物-药物相互作用(Drug-drug interactions,DDI)。在DDI的发生机制中,黄酮类化合物对药物转运体乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein,BCRP)的调控是其重要原因之一。BCRP是ATP结合盒(ATP binding cassette,ABC)转运蛋白超家族的一个重要亚型,广泛分布于人体的肠道、肝脏、血脑屏障、胎盘屏障等组织中,在药物和外源性毒素的处置中发挥重要作用。通过调控BCRP介导的外排作用,其底物药物的血药浓度、生物利用度和清除率等药代动力学特征会受到影响,引起DDI。此外,肿瘤细胞BCRP的过表达可增加细胞毒药物的外排从而导致药物化疗产生多药耐药(Multi-drugresistance,MDR),通过抑制BCRP介导的外排作用,可能逆转MDR,恢复肿瘤的化疗敏感性。本研究应用人源化BCRP高表达的稳转细胞株BCRP-MDCKⅡ细胞模型,研究了日常食物和中草药中常见的99种黄酮类化合物对BCRP活性的影响,筛选出对BCRP具有较强抑制活性的黄酮。从细胞水平考查黄酮对BCRP抑制作用的生物学效应。然后应用整体动物模型评价黄酮对米托蒽醌药代动力学特征的影响。通过分子对接模型分析黄酮抑制剂对BCRP产生抑制作用的分子机制。应用药效团模型进一步研究黄酮与BCRP之间的构效关系。为黄酮化合物的结构优化以及预测临床潜在的食物-药物相互作用提供实验依据。具体研究结果如下:1.99 种黄酮类化合物对药物转运体BCRP活性的影响1.1 BCRP-MDCK Ⅱ细胞摄取实验筛选结果表明,11种黄酮对BCRP具有显著的抑制作用(>50%),包括穗花杉双黄酮,芹菜素,鹰嘴豆芽素A,白杨素,地奥司明,芫花素,金丝桃素,山奈酚,山奈素,甘草查尔酮A和柚皮素,另外有49种黄酮对BCRP的抑制作用较弱(20-50%),剩下的39种黄酮对BCRP几乎无抑制作用(<20%)。1.2 在BCRP-MDCK Ⅱ细胞中,对抑制率高于50%的化合物进行了抑制强度IC50的测定,结果表明对BCRP抑制活性最强的是穗花杉双黄酮(IC50=4.33μM),其次是山奈素(IC50=4.73μM),金丝桃素(IC50=6.64 μM),山奈酚(IC50=15μM),地奥司明(IC50=16.65 μM),柚皮素(IC50=19.41 μM),白杨素(IC50=20.03 μM),芹菜素(IC50=23.51 μM),鹰嘴豆芽素A(IC50=24.13 μM),甘草查尔酮A(IC50=33.48 μM)和芫花素(IC50=36.64 μM)。2.黄酮类化合物对药物转运体BCRP抑制作用的生物学效应评价2.1 在BCRP-MDCKⅡ细胞中,上述11种黄酮抑制剂和阳性抑制剂KO143均能使多柔比星的细胞毒性增加,细胞存活率降低,其中,白杨素,金丝桃素,甘草查尔酮A和芹菜素作用最为明显,使多柔比星在低浓度(0.025μM)时也具有较强毒性,细胞存活率曲线明显下移。上述结果提示,黄酮抑制剂可能通过抑制BCRP外排作用,减少细胞毒药物的释放,从而增强多柔比星的细胞毒性。2.2 在脑胶质瘤细胞U251、替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)耐药的U251T和T98G细胞中,上述1 1种黄酮抑制剂和阳性抑制剂KO143均能显著增加TMZ在耐药细胞株U251T和T98G中的细胞毒性,其作用明显大于U251。其中甘草查尔酮A和芫花素的作用最为显著,对BCRP的抑制活性>95%,使U251T和T98G细胞的存活率曲线显著下移,在U251T细胞中使TMZ的IC50值从939.9μM分别降到1.22μM和1.31 μM,T98G细胞中使TMZ的IC50值从1385μM分别降到20.7μM和44.92μM。上述结果提示黄酮抑制剂可能通过抑制BCRP来逆转U251T和T98G对TMZ的耐药性。2.3 在SD大鼠体内黄酮抑制剂对BCRP抑制作用的生物学评价结果表明,SD大鼠提前30min 口服上述11种黄酮后,米托蒽醌的AUC0-t与单独给药组相比均不同程度的升高,其中芹菜素,柚皮素,甘草查尔酮A,山奈酚和白杨素使米托蒽醌的AUC0-t升高30.10%～81.97%,强于阳性抑制剂KO143的25.62%。上述结果提示,黄酮抑制剂在SD大鼠体内对BCRP的调控可影响到底物药物米托蒽醌的体内暴露量。3.黄酮类化合物抑制药物转运体BCRP的分子机制和构效关系研究3.1 分子对接技术可从分子水平解释配体分子和受体蛋白之间的作用机制。将黄酮化合物与BCRP结构进行分子对接,结果表明黄酮化合物与BCRP的氨基酸残基Phe439之间形成的Pi-Pi和/或与Val546形成的Pi-Alkyl相互作用可能是黄酮类化合物对BCRP产生较强抑制作用的关键因素,且形成键的数量可能与抑制活性的大小有关,而氢键则对抑制作用影响不大。3.2 黄酮类化合物与BCRP的药效团计算结果表明,黄酮类化合物的核心骨架区域芳香环(B环)是黄酮对药物转运体BCRP产生抑制活性的关键功能团,而5位和7位的氢键受体及4’位的疏水基团会对抑制活性产生重要影响,当这些位置与具有较大空间位阻的基团如葡萄糖结合,黄酮对BCRP的抑制活性会明显减小甚至消失,例如芹菜素和芹菜苷,柚皮素和柚皮苷。药效团模型的构建可初步阐明黄酮类化合物和BCRP之间的构效关系,进一步指导黄酮抑制剂的结构优化。综上所述,本研究应用BCRP高表达的BCRP-MDCKⅡ稳转细胞株,对99种黄酮类化合物进行初步筛选和体内外抑制作用的生物学效应评价,应用分子对接技术初步阐明了黄酮化合物对BCRP产生较强抑制作用的分子机制,药效团模型的构建可初步阐明黄酮类化合物和BCRP之间的构效关系,为指导黄酮类化合物的结构优化,开发高效低毒的BCRP选择性抑制剂来逆转肿瘤多药耐药提供有价值的参考依据。Ⅱ黄酮类化合物对药物转运体OATP1B1的调控及分子机制有机阴离子转运多肽 1B1(Organic anion transporting polypeptides 1B1,OATP1B1)是一种特异性表达于肝细胞基底外侧膜上的摄取转运体,介导多种药物及内源性物质摄取进入肝脏,在底物药物的肝脏暴露和清除方面起着重要的调节作用。OATP1B1的肝脏摄取可能会造成细胞内药物、胆汁成分的积聚,进而引起胆汁淤积及药物性肝损伤(Drug induced liver injury,DILI)。因此开发高效低毒的OATP1B1抑制剂对减轻OATP1B1介导的DILI具有重要意义。黄酮类化合物是一类具有众多药理活性的天然产物,在食物和中草药中广泛分布,具有良好的安全性。但也有研究报道一些黄酮能够通过抑制OATP1B1引起DDI。本研究应用人源化OATP1B1高表达的OATP1B1-HEK293细胞模型,研究了常见食物和中草药中富含的99种黄酮类化合物对OATP1B1活性的影响,筛选出对OATP1B1具有较强抑制活性的黄酮。从细胞水平考查黄酮对OATP1B1抑制作用的生物学效应,然后应用整体动物模型评价黄酮对甲氨蝶呤药代动力学特征的影响。通过波生坦诱导大鼠肝损伤模型评价黄酮的肝保护作用。应用药效团模型进一步研究黄酮与OATP1B1之间的构效关系。为黄酮化合物的结构优化以及预测临床潜在的食物-药物相互作用提供实验依据。具体研究结果如下:1.99种黄酮类化合物对药物转运体OATP1B1活性的影响1.1 OATP1B1-HEK293细胞摄取实验筛选结果表明,8种黄酮对OATP1B1具有显著的抑制作用(>50%),包括鹰嘴豆芽素A,高车前素,异甘草素,异橙黄酮,山奈酚,甘草查尔酮A,木犀草素和甜橙黄酮,另外有59种黄酮对OATP1B1的抑制作用较弱(20-50%),剩下的32种黄酮对OATP 1B 1几乎无抑制作用(<20%)。1.2 在OATP1B1-HEK293细胞中,对抑制率高于50%的化合物进行了抑制强度IC50的测定,结果表明对OATP1B1抑制活性最强的是甘草查尔酮A(IC50=7.96 μM),其次是木犀草素(IC50=22.03 μM),鹰嘴豆芽素A(IC50=22.28μM),高车前素(IC50=32.7 μM),山奈酚(IC50=33.05 μM),异甘草素(IC50=33.14 μM),甜橙黄酮(IC50=40.15 μM)和异橙黄酮(IC50=47.48μM)。2.黄酮类化合物对药物转运体OATP1B1抑制作用的生物学效应评价2.1 在OATP1B1-HEK293细胞中,上述8种黄酮抑制剂和阳性抑制剂利福平均能使MTX的细胞毒性减小,细胞存活率上升,其中,木犀草素作用最为明显,使MTX在50-100μM时,OATP1B1-HEK293细胞存活率曲线明显上移。上述结果提示,黄酮抑制剂可能通过抑制OATP1B1摄取作用,减少药物进入细胞,从而降低MTX的细胞毒性。2.2 在SD大鼠体内黄酮抑制剂对OATP1B1抑制作用的生物学评价结果表明,SD大鼠提前30min口服上述8种黄酮后,使MTX的AUC0-t与单独给药组相比升高28.27%-82.71%,弱于阳性抑制剂利福平的208.21%。上述结果提示,黄酮抑制剂在SD大鼠体内对OATP1B1的调控可影响到底物药物MTX的体内暴露量。2.3 在波生坦诱导的SD大鼠肝损伤模型中,上述8种黄酮均能明显降低大鼠血清总胆汁酸(Total Bile Acid,TBA)水平,且使肝内波生坦浓度与单独给药组相比减少7.12%-54.17%。上述结果提示,黄酮抑制剂可能通过抑制OATP1B1摄取作用,减少波生坦摄取进入肝脏,从而发挥保肝作用。3.黄酮类化合物与药物转运体OATP1B1的构效关系研究黄酮类化合物与OATP1B1的药效团计算结果表明,黄酮类化合物4’位和5位的氢键受体及7位的氢键供体是黄酮抑制剂对药物转运体OATP1B1产生抑制活性的关键功能团,当这些位置与具有较大空间位阻的基团如葡萄糖结合,黄酮抑制剂对OATP1B1的抑制强度会明显减小甚至消失,如异甘草素和异甘草苷,山奈酚和山奈苷。药效团模型的构建可初步阐明黄酮类化合物和OATP1B1之间的构效关系,进一步指导黄酮抑制剂的结构优化。综上所述,本研究应用OATP1B1高表达的OATP1B1-HEK293稳转细胞株,对99种黄酮类化合物进行初步筛选和体内外抑制作用的生物学效应评价,并应用大鼠肝损伤模型进一步考察了黄酮化合物的肝保护作用。药效团模型的构建可初步阐明黄酮类化合物和OATP1B1之间的构效关系,为指导黄酮类化合物的结构优化,开发高效低毒的OATP1B1选择性抑制剂来减轻DILI提供有价值的参考依据。Ⅲ银杏叶片对BCRP和OATP1B1底物药物的血浆药代动力学影响银杏叶片是将银杏叶的提取物通过现代药学技术加工制成的片剂,具有活血化瘀通络等功效,目前已广泛用于治疗冠心病稳定型心绞痛、中风等多种疾病。银杏叶片的主要成分之一为银杏黄酮类化合物,包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素等,本课题前期研究发现山奈酚对药物转运体BCRP和OATP1B1具有较强的抑制作用,因此有必要进一步探讨富含山奈酚的银杏叶片对BCRP和OATP1B1的影响,更好地指导银杏叶片临床合理用药。本研究选择市售银杏叶片、BCRP的底物米托蒽醌、OATP1B1的底物波生坦以及BCRP和OATP1B1的共同底物氟伐他汀钠,考察了银杏叶片对BCRP或OATP1B1底物药物在大鼠体内药代动力学特性的影响,为银杏叶片的临床合理使用提供参考依据。具体研究结果如下:1.银杏叶片对米托蒽醌在雄性SD大鼠体内药代动力学的影响SD大鼠提前口服阳性抑制剂KO143、山奈酚或银杏叶片后,使米托蒽醌的AUC0-t与单独给药组相比分别升高了34.80%,22.78%和26.63%,上述结果提示,银杏叶片在SD大鼠体内对BCRP的调控可影响到底物药物米托蒽醌的体内暴露量,存在DDI的风险。2.银杏叶片对波生坦在雄性SD大鼠体内药代动力学的影响SD大鼠提前口服阳性抑制剂利福平或山奈酚后,使波生坦的AUC0-t与单独给药组相比分别升高了219.43%和9.56%;而提前口服银杏叶片后,波生坦的AUC0-t下降了56.72%,这可能是银杏叶片中的山奈酚浓度未达到抑制浓度或其它成分产生的不同调控所致。上述结果提示,银杏叶片在SD大鼠体内可减少波生坦的体内暴露量,临床用药需注意剂量调整。3.银杏叶片对氟伐他汀钠在雄性SD大鼠体内药代动力学的影响SD大鼠提前口服阳性抑制剂利福平/KO143或山奈酚后,使氟伐他汀钠的AUC0-t与单独给药组相比分别升高了51.99%,23.02%和5.18%;而提前口服银杏叶片后,氟伐他汀钠的AUC0-t下降了30.75%,这可能是银杏叶片中的山奈酚浓度未达到抑制浓度或其它成分产生的不同调控所致。上述结果提示,银杏叶片在SD大鼠体内可减少氟伐他汀钠的体内暴露量,临床用药需注意剂量调整。综上所述,本研究评价了市售银杏叶片对药物转运体BCRP的底物药物米托蒽醌、OATP1B1的底物药物波生坦以及BCRP和OATP1B1的共同底物药物氟伐他汀钠在大鼠体内药代动力学特征的影响,为临床上银杏叶片与米托蒽醌、波生坦以及氟伐他汀钠的合用提供参考依据。