重症难治性休克(Severe irreversible shock)是指休克的晚期,经过输血补液和各种改善微循环为主的抗休克治疗以后,病情仍然恶化,发生死亡。已有报告线粒体病变参与了休克、感染、脓毒症时多器官功能不全(MODS)的发生。另外在重症休克研究中,已证实平滑肌线粒体发生了损伤,它带来了ATP生成减少。表现为线粒体肿胀,膜嵴排列紊乱,通透性转变孔开放,线粒体膜电位(△ψm)减低,治疗后小动脉血管平滑肌细胞(Arterial smooth muscle cells, ASMCs)内ATP仍明显减少,线粒体保护剂(CsA、虎杖苷)有一定治疗作用,提示细胞线粒体的功能与休克之间存在着密切的关系。但血小板线粒体功能与脓毒症的转归之间的关系有不同的报道,有人报道血小板线粒体呼吸暂时性增强与脓毒症病人的预后呈负相关,而另有人报道血小板线粒体细胞色素C氧化酶活性在脓毒血症死亡组病人中下降得更为显著。本项研究欲查明重症休克大鼠血小板是否发生线粒体损伤,休克不同时间、程度时线粒体损伤是否存在差别,能否根据线粒体损伤程度推断出休克轻重程度,及保护线粒体后血小板线粒体变化,为临床重症休克的诊断和治疗提出新思路。为此本实验利用重症失血性休克模型,设立休克不同时间,造成不同休克程度,以及休克再输血治疗组,采用ATP含量测定,透射电镜观察,线粒体膜电位检测,线粒体通透性转变孔状态检测,过氧化脂质的检测以及溶酶体稳定性的检测等方法分析线粒体功能状态,探讨休克时间及程度与线粒体功能的关系。方法SPF级Wistar大鼠,由南方医科大学实验动物中心提供,体重(200±20g)随机分六组：假手术组,休克30min,60min,120min组,休克120min+生理盐水+输血组(NS组),休克120min+虎杖苷+输血组(PD组)。用我室已建立的重症失血性休克模型,大鼠用麻药(由13.3%乌拉坦和0.5%氯醛糖溶于100ml生理盐水中配置而成)肌肉注射(0.65ml/kg)麻醉。双侧动脉及单侧静脉插管,动脉插管用来放血以及监测平均动脉压(MAP),静脉插管则用来液体回输。假手术组：进行动静脉插管等手术,但不复制休克模型,作为阴性对照。休克组,将大鼠快速放血(10分钟内)使血压降至30mmHg左右分别维持30,60,120min。 PD组,为休克维持120min后静脉给虎杖苷(30mg/kg)0.6ml,5min后输回全血,观察120min。NS组,为休克维持120min后静脉给与虎杖苷等同体积的生理盐水,5min后输回全血,观察120min。以上各组血液均用注射器收集并用肝素抗凝。模型结束后,各组大鼠均采用腹主动脉插管取血,50UI/ml肝素化。所取血液用Percoll梯度密度离心法分离血小板。各组血小板制作成电镜标本后用透射电镜观察线粒体超微结构变化；用荧光素—荧光素酶试剂盒来检测血小板线粒体ATP水平；用血小板内Calcein荧光强度判断血小板线粒体通透性转变孔状态；采用JC-1探针来检测细胞线粒体跨膜电位(△ψm)的变化,用发射的绿色荧光的JC-1单体(低△ψm细胞)的细胞百分数(%)来说明血小板线粒体去极化比例；使用过氧化氢脂质(LPO)分析试剂盒检测血小板中的过氧化脂质含量；血小板溶酶体稳定性通过吖啶橙(Acridine Orange, AO)检测,用“苍白”细胞(Pale cells)的百分比来说明血小板溶酶体状态以及用细胞红色荧光的强弱判断溶酶体稳定性。结果1.血小板线粒体结构发生肿胀破坏透射电镜结果显示,随着休克时间的加长,休克程度的加深,线粒体肿胀愈发严重：假手术组,大鼠血小板线粒体双层膜结构完整,基质致密,内部嵴结构完整；休克30min组,线粒体发生部分肿胀,基质电子密度降低；休克60min组,线粒体肿胀加重,嵴断裂,基质电子密度降低；休克120min组线粒体肿胀越发明显,嵴断裂,出现电子透亮区和线粒体空泡； NS治疗组线粒体肿胀明显,嵴断裂,出现线粒体空泡；PD治疗组线粒体有一定程度的肿胀,但嵴结构相对完整。2.血小板内ATP含量明显下降与假手术组相比,休克60min,120min及NS组血小板线粒体的ATP水平发生显著性的减少,在休克120min时仅为假手术组的63.84±8.51%(P=0.000),生理盐水治疗后为50.75±9.15%(P=0.000)。PD组血小板ATP水平为假手术组的79.57±8.48%(P=0.011),显著高于休克120min组(P=0.045)及NS治疗组(P=0.001)。提示随着休克时间增加,休克程度加深,血小板线粒体功能受损加深,给予虎杖苷保护后,血小板线粒体受损程度减轻。3.血小板线粒体通透性转变孔开放血小板线粒体Calcein-AM及C02+共染荧光共聚焦结果显示,随着休克时间延长,线粒体钙黄绿素荧光逐渐减弱,流式结果同样显示随着休克时间延长,大鼠血小板中线粒体钙黄绿素荧光逐渐减弱,休克60min,120min以及NS组血小板的钙黄绿素荧光强度分别为197.20±56.15,175.16±58.33,165.09±1.44AU较假手术组(323.60±46.51AU)显著减弱(P=0.000,P=0.000,P=0.000)。PD组血小板Calcein-AM荧光(234.76±40.97AU)显著高于NS组(P=0.008),这说明虎杖苷减少休克时血小板线粒体通透转变孔的开放。4.血小板线粒体内膜跨膜电位降低用流式细胞仪检测荧光探针JC-1标记的血小板线粒体膜电位△ψm的改变,计数低△ψm细胞(JC-1单体,发绿色荧光)的含量。休克30min时低△ψm细胞含量为23.85±±6.05%,与假手术组(11.72±4.43%)相比显著增多(P=0.003),休克60min,120min时低△ψm细胞含量分别为32.40±3.27%,37.00±9.97%,提示在休克30mmin时就已经出现血小板线粒体膜电位去极化,而且随着休克时间增加和休克程度加深,去极化增多。PD治疗组中低△ψm细胞含量为16.09±4.50%,较NS治疗组(34.13±7.72%)显著减少(P=0.000),虎杖苷减少休克时血小板线粒体内膜跨膜电位的降低。5.血小板中过氧化脂质的含量增高单纯休克30,60,120min时血小板中过氧化脂质含量与假手术组相比,无统计学差异(P=0.848,P=0.875,P=0.951)。NS组血小板中过氧化脂质含量由假手术组3.06±0.42nmol/1.0×108增至4.33±1.09nmol/1.0×108显著高于假手术组(P=0.006)。PD组血小板中过氧化脂质含量显著少于NS组(P=0.007)。提示在缺血性休克过程中,过氧化脂质的产生并没有显著改变,在回输血再灌注后则大量产生。给予虎杖苷保护后,减少了过氧化脂质的产生。6.血小板溶酶体稳定性的下降血小板AO染色,共聚焦结果显示随着休克时间延长,荧光减弱,流式结果提示休克30min,60min,120min组以及NS组溶酶体受损细胞(Pale cells)含量分别为8.30±2.45、19.96±2.95、22.68±3.37%,较假手术组(3.97±0.62%)有显著增多(P=0.011,P=0.000,P=0.000),随着休克时间延长,溶酶体受损细胞含量增多。PD组中溶酶体受损细胞含量为7.12±2.90%与NS组(21.35±1.44%)相比,溶酶体受损细胞显著减少(P=0.000),说明虎杖苷改善休克时血小板溶酶体膜稳定性。7.各组大鼠体重、放血量、平均动脉压情况各组大鼠体重以及基础平均动脉压无统计学差异(P=0.223,P=0.402)。休克2h组,NS组,PD组的放血量,补血时间,补血量无统计学差异(P=0.669,P=0.821,P=0.997)。在给药回输血治疗30min后,NS组,PD组的平均动脉压(MAP)分别为51.40±10.80mmHg,71.06±5.73mmHg,二者有统计学差异(t=-3.937,P=0.003),PD组MAP高于NS组,随着观察时间增加,二者MAP差异越大,到回输血后120min, NS组,PD组的MAP分别为41.57±11.34,90.67±10.46mmHg,二者有显著性差异(t=-7.797,P=0.003)结论1.大鼠休克60min时,血小板ATP合成显著减少(P=0.002),ATP含量随着休克时间增加而减少,在休克120min+生理盐水+输血组中最为严重,为正常值的50.75±9.15%。2.在休克30min时就出现线粒体肿胀,嵴结构模糊消失,线粒体膜电位(△ψm)下降,以及溶酶体稳定性下降(苍白细胞增多)；休克60min时钙黄绿素荧光减弱(P=0.000),这些都提示微循环紊乱和线粒体功能不全共同导致血小板ATP水平下降。而在休克120min+虎杖苷+输血组中,上述各指标都有所改善,特别是血小板ATP水平恢复到正常值的约80%。3.重症休克血小板线粒体合成ATP功能减弱的机制包括：自由基脂质过氧化和溶酶体受损(在休克30min时即出现),线粒体通透转变孔开放(休克60min时即出现),线粒体内膜跨膜电位下降和线粒体肿胀破坏(休克30min时即出现)。4.虎杖苷治疗可使上述变化显著减轻,并使动物血压显著回升。总之,重症休克30-60min时发生血小板线粒体功能不全,提示血小板线粒体功能的检测可能作为重症休克诊断和治疗的一项非损伤性的简易指标。