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研究背景:糖尿病胃轻瘫(Diabetic gastroparesis,DGP)是糖尿病胃肠道最常见的并发症,常表现为非机械性梗阻情况下的胃动力障碍及胃排空延迟,目前DGP发病机制尚不明确。截止目前,自主神经病变、急性血糖升高及间质卡哈尔细胞(Interstitial Cahal cell,ICC)的损伤和缺失被认为是影响胃动力的主要因素。胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)主要由肝脏分泌,是结构与胰岛素有一定相似性的蛋白多肽。近年来的众多研究发现,IGF-1与糖尿病慢性并发症的发生、发展有着密切的关系。磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide3-kinase,PI3K)-丝氨酸蛋白激酶(Akt)通路是细胞内重要的信号通路。PI3K-Akt通路在许多糖尿病并发症中被激活,且为IGF-1下游信号。Zhang等人研究发现,PI3K-Akt通路参与了 DGP发生,并且随胃轻瘫的发展其表达逐渐降低。蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)家族有3种,包括经典型、新型及非典型PKC,其中经典型分为PKCα、PKCβⅠ、PKCβⅡ、PKCγ。经典PKC又称为Ca2+依赖型PKC,是PI3K-Akt的下游信号,该组PKC具有典型结构,有Ca2+结合区(C2区),依赖Ca2+活化,可被甘油二酯(Diacylglycerol.DG)和Ca2+等激活。PKC也参与Ca2+通道的开放,影响细胞外Ca2+的内流,对细胞内Ca2+浓度的变化影响作用巨大。Ca2+是真核细胞内广泛存在的且最重要的第二信使之一,可活化多种不同蛋白激酶,参与细胞的生长、分化、运动及细胞凋亡等多种生物学过程。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)与细胞损伤直接相关,主要表现为内质网腔内错误折叠蛋白、未折叠蛋白聚集、Ca2+平衡紊乱等。自噬是细胞一种高度保守的分解代谢途径,尤其在饥饿或应激状态下被激活。细胞自噬与ERS有着密切的相关性。ERS引起的大量未折叠蛋白或错误折叠蛋白、Ca2+浓度的变化等均能引起细胞自噬。而细胞自噬则能反过来抑制ERS,减少细胞凋亡,促进细胞生存。本实验旨在进一步阐明DGP的发生机制,并探讨IGF-1对DGP发生发展中的影响及作用机制,为临床探索新的治疗方案提供科学的理论依据与实验依据。研究目的:观察DGP大鼠胃平滑肌组织ERS、自噬及PI3K-Akt-PKC通路的变化;在不同糖浓度及不同时间下培养大鼠胃平滑肌细胞,观察IGF-1处理后对ERS、自噬及PI3K-Akt-PKC-Ca2+通路的变化,探讨IGF-1对DGP发生发展的影响及作用机制。材料与方法:制备DGP大鼠模型,并分为NC组与DM6W组,利用免疫荧光法观察大鼠胃平滑肌组织中ERS和自噬相关蛋白的变化;利用Western blot观察大鼠胃平滑肌组织中ERS、自噬及PI3K-Akt-PKC通路相关蛋白变化;体外培养大鼠胃平滑肌细胞,各培养24h和48h,分为普糖组、高糖组、普糖+IGF-1组和高糖+IGF-1组,共8组。通过ELISA法检测各组大鼠胃平滑肌细胞内PKC的活性;利用激光共聚焦观察细胞中GRP78、LC3及Ca2+浓度的变化;利用Western blot观察细胞中ERS、自噬及PI3K-Akt-PKC通路相关蛋白变化。结果:制备糖尿病大鼠模型,以糖尿病大鼠胃平滑肌组织为研究对象,免疫荧光法检测NC组与DM6w组GRP78、LC3的表达,结果发现DM6w组其两种蛋白的表达均明显高于NC组。Western blot检测相关蛋白的表达,结果发现DM6w组GRP78、CHOP及LC3Ⅱ的表达均明显高于NC组(P<0.001);DM6w组PI3K、p-Akt、及PKCα的表达均明显低于NC组(P<0.01);DM6w组PKCβ1的表达明显高于NC组(P<0.05)。体外培养大鼠胃平滑肌细胞,并在不同时间介入IGF-1。ELISA法检测各组胃平滑肌细胞内PKC的活性,结果发现在24h时,普糖组与高糖组PKC活性无明显差异(P>0.05);IGF-1介入后,普糖组与高糖组PKC活性均增高,且高糖组增高更明显;在48h时,高糖组PKC活性明显高于普糖组(P<0.01);IGF-1介入后,普糖组PKC活性无明显变化(P>0.05),而高糖组PKC活性明显增高(P<0.05)。激光共聚焦检测大鼠胃平滑肌细胞内Ca2+浓度的变化,结果发现,在24h与48h时,高糖组细胞内Ca2+浓度均高于普糖组(P<0.01);IGF-1介入后,高糖组细胞内Ca2+浓度明显降低(P<0.01),而普糖组细胞内Ca2+浓度反而增高(P<0.001)。激光共聚焦检测大鼠胃平滑肌内GRP78与LC3的表达,结果发现在24h时,高糖组GRP78表达明显高于普糖组(P<0.05),而高糖组与普糖组LC3的表达无明显变化(P>0.05);IGF-1介入后,普糖组GRP78的表达明显增高(P<0.001),高糖组GRP78表达无明显变化(P>0.05),而普糖组与高糖组LC3的表达均降低(P<0.05)。在48h时,高糖组GRP78的表达明显高于普糖组(P<0.001),而高糖组LC3的表达低于普糖组(P<0.05);IGF-1介入后,普糖组GRP78与LC3的表达均无明显变化(P>0.05),而高糖组GRP78与LC3的表达均明显降低(P<0.01)。Western blot检测相关蛋白的表达,结果发现在24h时,高糖组CHOP、GRP78和LC3II的表达均高于普糖组(P<0.05);IGF-1介入后,普糖组CHOP与GRP78的表达均增高(P<0.01),LC3I1的表达无明显变化(P>0.05);而高糖组CHOP与GRP78的表达无明显变化(P>0.05),LC3II的表达降低(P<0.05)。在48h时,高糖组CHOP、GRP78和LC3II的表达均高于普糖组(P<0.05);IGF-1介入后,普糖组CHOP与GRP78的表达无明显变化(P>0.05),LC3II表达明显增高(P<0.001);高糖组CHOP、GRP78和LC3II的表达均明显降低(P<0.01)。在24h时,高糖组PI3K、p-Akt、PKCα和p-PKCα的表达均低于普糖组(P<0.05),而高糖组PKCβ1与p-PKCβ1的表达高于普糖组(P<0.05);IGF-1介入后,普糖组PI3K、PKCβ1和 p-PKCβ1 的表达增高(P<0.05),p-PKCα 的表达降低(P<0.01),而 p-Akt、和 PKCα 表达无明显变化(P>0.05);高糖组 PI3K、p-Akt、PKCα、p-PKCα 和 p-PKCβ1.的表达均增高(P<0.05),而PKCβ1的表达无明显变化(P>0.05)。在48h时,高糖组PI3K、p-Akt、PKCα、p-PKCα和PKCβ1的表达均低于普糖组(P<0.05),而高糖组与普糖组p-PKCβ1的表达无明显变化(P>0.05);IGF-1介入后,普糖组PI3K、p-Akt、p-PKCβ1 和 PKCβ1 的表达均增高(P<0.05),而 PKCα 的表达降低(P<0.05),p-PKCα的表达无明显变化(P>0.05);高糖组PI3K、p-Akt、p-PKCβ1、p-PKCα和PKCβ1的表达均增高(P<0.05),而PKCα的表达无明显变化(P>0.05)。结论:在高糖条件下,IGF-1通过对大鼠胃平滑肌细胞PI3K-Akt-PKC通路的激活改善细胞内Ca2+稳态紊乱,进而抑制ERS与自噬的发生,对大鼠胃平滑肌细胞起到保护作用。