毒死蜱是一种广谱性有机磷杀虫剂,被广泛用于农业和城市卫生害虫的防治。同时毒死蜱也是一种持久性污染物,其残留对环境和人类健康有很大的危害。寻求高效、安全、经济的农药残留生物降解处理新技术,解决病虫害防治用药与农药残留的矛盾,是科研工作者需要迫切解决的科研命题。本实验对已分离得到的毒死蜱高效降解菌,玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)HW-D3菌株,进行降解基因的克隆,为构建基因工程菌做好前期研究。实验采用SDS-蛋白酶K法提取D3菌基因组DNA,经1%琼脂糖凝胶电泳检测,发现有明显的RNA污染,加1μl RNase酶后可有效去除RNA,所提取基因组DNA片段大于15kb。用紫外可见分光光度计测基因组DNA的OD260为0.102、OD280为0.055,经计算,浓度为0.5151μg/μl;其OD260/OD280为1.8545,在1.8～2.0之间,没有蛋白质和RNA的污染。由此可看出本研究制备的基因组的DNA片段完整、纯度高、浓度大,可以满足构建基因组文库的要求。采用同样的方法分别提取培养12 h、24 h、36 h的D3菌基因组DNA,经1%琼脂糖凝胶电泳检测,培养24h所提的基因组条带最亮。本研究采用能切割4个核苷酸序列的内切限制酶Sau3AⅠ酶(8U/μl)对基因组DNA进行酶切,研究发现倍比稀释内切酶的方法比较容易寻找到最佳酶量,结果表明在第1管中加入1μl Sau3AⅠ酶进行倍比稀释后,37℃酶切30min,基因组DNA大量富集在1～6kb范围内,可满足切割2～4kbDNA片段的要求。计算得最佳酶切浓度为0.243U/μg、0.121U/μg、0.061U/μg,按照这三个最佳浓度放大酶切体系,进行大量酶切反应,回收浓度和效率有较大的提高。用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收2～4kb的DNA片段,具有方便、快捷、稳定的特点,不需要酚抽提和乙醇沉淀,回收率在60%左右。取100μl的转化液涂布于LBS平板上,37℃培养18h后观察计数,白色菌落数量在70%-80%以上,转化效率达106 cfu/μg。采用高效感受态细胞DH5α常规转化,得到了近15000个转化子,远远超过了建库理论上需要的转化子。参照文献中已经报道的用于扩增毒死蜱降解菌YC-1 mpd基因的引物,以D3菌基因组DNA为模板进行PCR反应。经1%琼脂糖凝胶电泳,可以见到约为1kp的特异性电泳条带,与预计的大小相符,初步证明已成功的扩增出所需要的基因片段,将其回收克隆。PCR产物经纯化后,插入pMD18-T Vector载体的克隆位点,构建重组质粒。转化大肠杆菌DH5α后,取100μl涂布于LBS平板,白色菌落比率为96%。抽提克隆子的质粒,用XhoⅠ和NdeⅠ双酶切鉴定,经1%琼脂糖凝胶电泳检测,插入片段条带大小正确。用气相色谱测含该重组质粒的大肠杆菌DH5α对毒死蜱的降解能力,24h后对20mg/L的毒死蜱降解率达39.36%,比出发菌D3降解率高。