睾酮是调节雄性生理功能最重要的雄激素,主要由睾丸的莱迪希细胞(Leydig Cell)合成和分泌.经典的观点认为,莱迪希细胞合成和分泌睾酮的功能受到下丘脑-垂体系统分泌的激素的影响,其中垂体分泌的促黄体生成素(LH)是促进睾丸莱迪希细胞合成和分泌睾酮的主要因子.近年来的研究发现,生理浓度的内源性糖皮质激素和因情绪紧张等因素引起的血高糖皮质激素水平均能抑制睾丸莱迪希细胞中睾酮的合成.这是一个经糖皮质激素受体介导的对莱迪希细胞直接作用的过程.大鼠睾丸的莱迪希细胞中存在着高活性的、和糖皮质激素代谢有关的酶-11β-羟类固醇脱氢酶(11-βHSD),该酶能氧化皮质酮(大鼠体内的糖皮质激素),使其成为11β-脱氢皮质酮,后者无生物活性,所以不能对莱迪希细胞中睾酮的合成行使抑制作用.鉴于11β-HSD能以氧化灭活的方式控制糖皮质激素在细胞内的浓度,使之对睾酮合成所产生的抑制作用保持在一个适当的范围之内,因此,11β-HSD被认为是睾丸莱迪希细胞中糖皮质激素对睾酮合成所行使的抑制作用强弱的决定因素.睾丸的莱迪希细胞中存在两种类型的11β-HSD-11β-HSD1和11β-HSD2.11β-HSD1属于氧化还原酶,催化双向反应,在大鼠睾丸莱迪希细胞内其氧化活性占优势,11β-HSD2属于氧化酶,仅催化单向的氧化反应.在大鼠睾丸莱迪希细胞中,11β-HSD1和11β-HSD2 通过它们均具有的氧化酶活性共同抑制活性糖皮质激素-皮质酮的浓度,其中11β-HSD2起着主要的作用. 本研究以往的研究表明,LH可以诱导大鼠睾丸莱迪希细胞内11β-HSD1的表达,同时基于以上述及的各种研究结果的报道,本研究推测:除了经典的、LH直接促进睾丸莱迪希细胞合成和分泌睾酮的机制之外,可能还存在另外一种机制,即:LH可通过调控11β-HSD的表达和活性来影响睾丸莱迪希细胞内糖皮质激素的浓度,而后者对睾酮的合成和分泌具有负调控作用.有研究发现,LH在其他类型细胞内可以调节11β-HSD2的表达,但是有关LH是否调控莱迪希细胞中11β-HSD2活性与表达的研究尚未见有报道.本文有三个研究目标,首先是观察在大鼠睾丸莱迪希细胞中是否存在经LH诱导的11β-HSD2表达,其次是评价LH是否可调节莱迪希细胞内11β-HSD2的活性.最后是在前两个目标己被证实的基础上,研究LH调控11β-HSD2表达的分子机制. 本研究分为三个部分: 第一部分:LH调节大鼠睾丸莱迪希细胞中11β-HSD2表达及活性的研究以自成年Sprague-Dawley大鼠睾丸中分离、纯化的莱迪希细胞为研究对象,采用RT-PCR和Western Blot分别检测经不同剂量LH处理的莱迪希细胞内11β-HSD2 mRNA及蛋白质表达情况及莱迪希细胞在不同时间点上经LH处理后其细胞内相同指标的表达量.以薄层层析法检测经LH处理的莱迪希细胞内11β-HSD2氧化酶活性.构建糖皮质激素调控的萤火虫荧光素酶报告基因载体Luc-GRE,并将其瞬时转染进莱迪希细胞,后者分别经皮质酮、皮质酮+LH处理.最后,通过检测细胞内荧光素酶活性的差异来评价LH处理对莱迪希细胞内活性糖皮质激素浓度的影响. 本部分的实验结果显示:LH可以诱导大鼠睾丸莱迪希细胞内11β-HSD2的mRNA和蛋白质的表达,其诱导方式呈现时间依赖性和剂量依赖性.LH可促进11β-HSD2的氧化酶活性.皮质酮可上调转染L,uc-GRE的莱迪希细胞内荧光素酶活性,而LH处理则可抑制由皮质酮诱导升高的酶活性,提示:LH加强了莱迪希细胞对糖皮质激素的灭活。 第二部分:大鼠11β-HSD2基因5侧翼序列报告载体的构建及活性分析我们通过PCR克隆了大鼠基因组内11β-HSD2基因5侧翼序列的一1740～+45区间.在此基础上,经过一系列PCR扩增和限制酶酶切,将-1740～+45,1183～+45,.756～+45,226～+45,-138～+45,-35～+45区间分别插入到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,依次命名为：pGL3-hsdllb2-1740,pGL3-hsdllb2-1183,pGL3-hsdllb2-756,pGL3-hsdllb2-226,pGL3-hsdllb2-138,pGL3-hsdllb2-35。将上述各载体分别瞬时转染小鼠肿瘤莱迪希细胞(Mouse Tumor Leydig cell,MLTC-1),检测各载体在静息状态下及经LH处理后所表达的荧光素酶活性。 本部分的实验结果显示:在静息状态下,转染pGL3-hsdllb2-35的细胞内荧光素酶活性与转染其余五种载体的细胞相比呈显著降低.转染pGL3-hsdllb2-1740,pGL3-hsdllb2-1183,pGL3-hsdllb2-756,pGL3-hsdllb2-226,pGL3-hsdllb2-138的细胞内的荧光素酶活性在LH处理后均呈显著升高,随着5侧翼序列的不断缩短,荧光素酶活性升高的程度呈下降趋势,转染pGL3-hsdllb2-35的细胞内酶活性在LH处理后没有变化.此结果提示:富含GC的-138～+45区间为启动11β-HSD2基础转录所必需. 第三部分:LH调节睾丸莱迪希细胞中11β-HSD2表达机制的研究第二部分的研究结果提示:-138～+45区间的GC丰富区为启动11β-HSD2转录的核心区域,该区间内含有多个Sp1结合位点.对其他基因的研究表明:LH促进的转录需要Sp1的参与,由此我们推测:Sp1可能参与LH上调莱迪希细胞内11β-HSD2的表达.为此,我们构建了Sp1的表达载体pcDNA-sp1,并在pGL3-hsdllb2-1740的基础上定点突变.138～+45区间的Sp1结合位点.-1384～-128区间Sp1结合位点突变的载体命名为pGL3-splmutl,-56～-40区间Sp1结合位点突变的载体命名为pGL3-splmut2,上述两个区间Sp1结合位点全部突变的载体命名为pGL3-splmut12.将pcDNA-sp1与pGL3-hsdllb2-1740瞬时共转染 MLFC-1 后检测荧光素酶活性.将pGL3-splmutl, pGL3-splmut2, pGL3-splmutl2分别瞬时转染MLTC-1,检测静息状态下的荧光素酶活性,另以1IU/mlLH处理MLTC-1 细胞12小时,然后检测荧光素酶活性.结果显示:pcDNA-spl未能大幅上调 pGL3-hsdllb2-1740 的活性.转染GL3-splmut1 和pGL3-splmut2 的细胞内荧光素酶活性与转染:pGL3-hsdllb2-1740 细胞相比无显著差异,但是转染 pGL3-splmut12 细胞的酶活性下降了30﹪. 经LH处理后,转染 pGL3-splmutl, pGL3-splmut2,pGL3-splmut12的MLTC-1细胞内荧光素酶的活性仍有升高,并且升高程度与pGL3-hsdllb2-1740无显著差异.这一结果提示：虽然Spl在启动11β-HSD2基础转录方面有重要作用,但是它并不参与LH上调11β-HSD2转录的过程. 近年来的研究发现,孤儿核受体型转录因子Nur77参与经LH刺激的莱迪希细胞内睾酮的合成和分泌,Nur77能调控一些与睾酮合成及与代谢有关的酶的转录.本研究采用RNA干扰技术下调MLTC-1细胞内Nur77的表达,然后将 pGL3-hsdllb2-1740瞬时转染入低表达Nur77的 MLTC-1细胞中,后者经1 IU/ml LH处理12小时,检测细胞内荧光素酶的活性.结果显示,静息状态下,RNA干扰组与对照组细胞内的荧光素酶活性无显著差异；经LH处理后,RNA干扰组细胞内的酶活性与对照组相比呈显著下降.将Nur77表达质粒和六个含11 β-HSD2基因5侧翼序列的荧光素酶报告基因载体瞬时共转染MLTC-1细胞后发现:转染 pGL3-hsdllb2-1740,pGL3-hsdllb2-1183,pGL3-hsdllb2-756,pGL3-hsdllb2-226的细胞内荧光素酶活性呈显著升高,而转染pGL3-hsdllb2-138,pGL3-hsdllb2-35的细胞内酶活性无显著变化.这一结果提示:在1lβ-HSD2基因5侧翼序列-226～-138区间具有应答Nur77的反应元件。 综上所述,本文的研究结果表明，LH可上调大鼠睾丸莱迪希细胞内11β-HSD2的表达,并且呈时间依赖性和剂量依赖性.LH通过上调11β-HSD2表达,可加强莱迪希细胞内该酶灭活糖皮质激素的能力.大鼠11β-HSD2基因5侧翼序列的138～+45区间是启动该基因转录的核心区域。虽然Spl对11β-HSD2基因的基础转录有重要作用,但Spl并不参与LH上调11β-HSD2的表达.Nur77则可通过11β-HSD2基因5侧翼序列.226～138区间介导LH上调11β-HSD2基因的转录。 LH和糖皮质激素分别属于促进和抑制睾丸莱迪希细胞合成和分泌睾酮的重要激素,而11β-HSD2是睾丸莱迪希细胞内灭活糖皮质激素的主要因素.LH可直接促进莱迪希细胞合成和分泌睾酮,本研究认为,除了这一经典的作用机制外,LH还可能通过上调11β-HSD2表达,加强其对糖皮质激素的灭活来完善这一调节过程.这一新机制的确立将使人们对生殖内分泌调控体系的高精细性和复杂性有更深的理解,对睾丸莱迪希细胞中睾酮合成调控的分子机制的认识也更趋深入与完善。