研究背景和目的急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是造血干细胞/祖细胞异常增殖的一种血液系统恶性肿瘤。随着AML发病率在过去的二十年中增加了20%,它成为一种严重的健康问题,急需严格的监测和创新的治疗策略。过去四十年中,治疗AML的基础化疗方案仍为DA（柔红霉素,Daunorubicin;阿糖胞苷,Ara-C,即DA）（3+7）方案,即3天静脉输注柔红霉素联合7天静脉输注阿糖胞苷,此化疗方案在青年患者的完全缓解率为60%-80%,老年患者的完全缓解率为40%-60%,只有20%-30%的患者可以长期无病生存,大多数患者死于耐药或者疾病的复发。DA化疗方案的剂量越大,完全缓解率虽越高,但是心脏毒性和骨髓抑制不良反应也越大。骨髓抑制患者如果不及时治疗,将会出现严重的感染。因此寻找增加DA疗效和减少其不良反应的药物具有重要意义。佛波酯即12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA）,是从巴豆油提取的一种化合物,其与第二信使二酰基甘油性质相似,可以活化蛋白激酶C,激发下游信号通路级联反应,影响细胞增殖、分化、迁移、侵袭等。研究较多的是它能诱导肿瘤细胞分化、特别是髓系白血病细胞分化,在较低浓度即可促进THP-1、K562、HL-60、U937和MEG-01等白血病细胞系分化和凋亡、诱导人原代白血病细胞分化、获得部分成熟细胞的标志和功能。和部分化疗药物联合可以增强化疗药物的活性,减少毒性,提示TPA具有潜在的治疗价值,但体内的研究少有报道。TPA也可以调节细胞因子的表达以及细胞对细胞因子和其他配体的反应,药代动力学和机体的生物学因素也可能导致体内和体外暴露于TPA之间的作用差异。因此,本研究希望在体外研究的基础上,重点考察TPA在白血病动物模型体内是否仍然有治疗作用以及和髓系白血病化疗最常用的DA方案联合,是否可以增强疗效。方法1 TPA对DA化疗方案的体外增效作用1.1细胞培养人源白血病细胞株THP-1用含有10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养基在5%CO₂饱和湿度的恒温无菌培养箱中培养,隔天传代一次;鼠源白血病细胞株WEHI-3用含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基在5%CO₂饱和湿度的恒温无菌培养箱中培养,隔天传代一次。1.2 MTT法检测细胞增殖MTT法检测TPA联合DA化疗方案对THP-1、WEHI-3细胞增殖的影响,采用Prism软件绘制量效曲线关系,采用SPSS软件统计分析数据。2 TPA联合DA化疗方案对白血病小鼠的体内作用2.1 TPA联合DA化疗方案对白血病模型小鼠的死亡率和存活时间的影响Balb/c小鼠共分为八组,正常对照组,模型组,TPA低剂量组,TPA高剂量组,DA低剂量组,DA高剂量组,DA低剂量与TPA联合组（100μg/kg）,DA高剂量与TPA联合组（100μg/kg）,除正常对照组外,其余各组小鼠一次静脉注射1×10⁶个WEHI-3细胞后,第十一天开始,TPA低剂量组和高低剂量组分别连续三天静脉注射TPA50μg/kg和100μg/kg,DA低剂量组连续三天静脉注射柔红霉素3 mg/kg和阿糖胞苷50 mg/kg,DA高剂量组连续三天静脉注射柔红霉素5 mg/kg和阿糖胞苷75 mg/kg。一周后DA高、低剂量组与TPA联合组均连续三天静脉注射TPA 100μg/kg,观察各组小鼠死亡率和存活时间的情况,每天记录动物体重和观察小鼠状态。2.2 TPA联合DA化疗方案对白血病模型小鼠骨髓原始和幼稚细胞比例的影响Balb/c小鼠共分为5组,分别为正常对照组,模型组,TPA组,DA组,DA与TPA联合组,除正常对照组外,其余各组小鼠均尾静脉注射1×10⁵个WEHI-3细胞,注射WEHI-3细胞第25天后,TPA组静脉注射TPA 100μg/kg,连续五天,DA组静脉注射柔红霉素4 mg/kg和阿糖胞苷50 mg/kg,连续三天。DA与TPA联合组在柔红霉素和阿糖胞苷注射完成后,静脉注射TPA100μg/kg,连续五天。第三十七天统一处死小鼠,用磷酸盐缓冲液冲洗股骨,离心,弃上清,涂片并用瑞氏吉姆萨染液染色,在显微镜下计数骨髓200个有核细胞中,原始和幼稚细胞比例,随机选取三个视野,重复计数三次取均值。2.3 TPA对DA化疗方案引起骨髓抑制的影响动物分组和给药同2.2,注射WEHI-3细胞第25天后,小鼠眼眶采血,检测外周血细胞数量的变化,待DA方案完成后第二天,DA组、DA+TPA组、正常对照组小鼠眼眶采血,检测骨髓抑制情况。待TPA给药完成后,同样眼眶采血,检测TPA是否具有升高白细胞的作用。结果1 TPA对DA化疗方案的体外增效作用1.1 TPA、DA对THP-1、WEHI-3细胞增殖的影响TPA在较低浓度对THP-1细胞和WEHI-3细胞均有明显的增殖抑制作用,DA方案作用于THP-1细胞48小时后,IC₅₀为15.02/75.10 nmol/L,作用于WEHI-3细胞后,IC₅₀为2.25/11.27 nmol/L。TPA和DA均能对THP-1和WEHI-3细胞的增殖产生抑制作用。1.2 TPA联合不同浓度的DA化疗方案对THP-1、WEHI-3细胞增殖的影响TPA（1.62 nmol/L）未见显著增加研究浓度范围内（13.80 nmol/L-55.20nmol/L）的DA方案对THP-1的增殖抑制的作用。而TPA（1.62 nmol/L）可以显著增加研究范围浓度内的（2.75 nmol/L-11.04 nmol/L）的DA方案对WEHI-3的增殖抑制的作用。2 TPA联合DA化疗方案对白血病模型小鼠的作用2.1白血病小鼠模型的建立小鼠注射1×10⁶个WEHI-3白血病细胞后,注射WEHI-3细胞后第十天左右小鼠精神状态开始变差,毛色黯淡稀疏,发病晚期小鼠双下肢瘫痪,肝脾肿大,外周血白细胞数值（45.91±24.00）×10⁹/L明显高于未注射细胞前白细胞数值（7.02±0.83）×10⁹/L（P<0.05）,且外周血涂片可发现幼稚细胞,骨髓中原始和幼稚细胞比例大于20%,说明小鼠注射1×10⁶个WEHI-3细胞后,可建立白血病小鼠模型。2.2 TPA联合DA化疗方案对白血病模型小鼠死亡率和存活时间的影响小鼠注射WEHI-3细胞后,截止到观察终止日期第41天,模型组死亡率为90%,与正常对照组相比,死亡率明显升高（P<0.001）。TPA高剂量组的死亡率为90%,低剂量组的死亡率为90%。低剂量DA组的死亡率为100%,低剂量DA联合TPA组的死亡率为50%,与模型组相比,死亡率明显降低（P<0.05）,与低剂量DA组相比,死亡率明显降低（P<0.05）。高剂量DA组的死亡率为60%,高剂量DA联合TPA组的死亡率为20%,与模型组相比,死亡率明显降低（P<0.01）,与高剂量DA组相比,死亡率明显降低（P<0.05）。截止到观察终止日期第41天,模型组小鼠中位生存期为25.5天,TPA高、低剂量组的中位生存期均为27.5天,低剂量DA组的中位生存期为37.5天,显著高于模型组（P<0.01）,低剂量DA联合TPA组死亡率小于50%,显著高于模型组的中位生存期（P<0.0001）,低剂量DA联合TPA组的中位生存期显著高于低剂量DA组（P<0.01）。高剂量DA组与高剂量DA联合TPA组死亡率均不到50%,高剂量DA组与高剂量DA联合TPA组的中位生存期均显著高于模型组（P<0.0001）,与高剂量DA组相比,高剂量DA联合TPA组的中位生存期显著延长（P<0.05）。2.3 TPA联合DA化疗方案对白血病模型小鼠骨髓原始和幼稚细胞比例的影响注射细胞第三十六天,模型组小鼠原始和幼稚细胞比例（43.70±24.08）%,与正常对照组（5.58±0.89）%相比,明显升高（P<0.05）。经过化疗后,小鼠骨髓象得到缓解,TPA与DA联合组的原始和幼稚细胞比例（6.82±3.13）%与模型组（43.70±24.08）%相比,明显降低（P<0.05）,DA组的原始和幼稚细胞（10.75±4.89）%比例趋于正常。2.4 TPA联合DA化疗方案对白血病模型小鼠肝脾病理的影响模型组小鼠脾脏和肝脏可见大量白血病浸润,脾脏结构排列紊乱,局部细胞坏死。肝脏小叶结构基本正常,中央静脉充血,肝细胞肿胀并伴有坏死。其余各组小鼠肝脾无明显白血病细胞浸润。2.5 TPA联合DA化疗方案对白血病模型小鼠脏器指数的影响模型组小鼠脾脏指数（1.19±1.11）与正常对照组（0.39±0.02）相比,无统计学差异,其余肝脏、心脏、肺脏指数等各组之间均无统计学差异。2.6 TPA对DA化疗方案引起骨髓抑制的影响化疗结束后第二天,与正常对照组（6.64±2.49）×10⁹/L相比,DA组白细胞数（3.73±1.37）×10⁹/L和联合组白细胞数值（3.69±1.43）×10⁹/L均有降低趋势,但无统计学差异。DA与TPA联合给药组给予TPA后的白细胞数值（12.73±4.56）×10⁹/L明显高于DA组的白细胞数值（5.54±2.12）×10⁹/L（P<0.05）,表明TPA可能加快白细胞回升,减轻DA所致的骨髓抑制。2.7 TPA和DA化疗方案对白血病模型小鼠体重的影响注射WEHI-3细胞后第二十四天,模型组小鼠体重（19.81±2.65）g与正常对照组（23.41±1.57）g相比,具有统计学差异（P<0.05）。TPA低剂量组的体重（21.13±0.55）g和TPA高剂量组的体重（20.84±2.03）g与模型组的体重相比,均无统计学差异。且TPA对DA化疗方案组动物体重无明显影响。结论1 TPA协同DA抑制WEHI-3细胞的增殖。2 TPA在动物体内可以增强DA化疗方案的治疗作用。