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第一部分:Insl6对单侧输尿管梗阻(UUO)模型小鼠肾脏纤维化的抑制作用及机制研究目的:探讨Insl6对单侧输尿管梗阻诱导的肾脏间质纤维化的作用及机制。方法:采用C57BL/6野生型小鼠建立左侧输尿管结扎梗阻模型,于术后3、7、10天处死,取手术侧肾脏组织,HE及Masson染色方法检测肾脏损伤及纤维化严重程度。24只C57BL/6雄性随机小鼠分为假手术组(Sham),UUO+生理盐水(NS)组,UUO+Insl6组。NS及Insl6通过微量泵皮下泵入,术后10天处死小鼠,取手术侧肾脏组织。分别采用HE及Masson染色方法检测肾脏损伤及纤维化程度。免疫组化检测α-SMA、E-cadherin、FN、和TGF-β1在肾脏组织的表达水平。RT-PCR检测α-SMA、E-cadherin、FN和TGF-β1 m RNA表达,Western Blotting检测TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白及其磷酸化的水平。结果:(1)UUO术后随时间延长,肾脏组织损伤及纤维化程度逐渐加重,10天(12.48±0.43 vs 0.15±0.28)时最显著(P<0.05)。(2)与Sham组相比,UUO+NS组术后10天肾脏损伤程度及纤维化程度(13.15±1.66vs 2.21±0.64)显著增加(P<0.05);与UUO+NS组相比,UUO+Insl6组肾脏炎症程度及纤维化程度(7.71±1.22 vs 13.15±1.66)则显著减轻(P<0.05)。(3)与Sham组相比,UUO+NS组免疫组化显示α-SMA(20.07±2.49 vs 1.72±0.59)、FN(14.66±1.2 vs 2.35±0.34)和TGF-β1(16.09±2.05 vs 1.77±0.74)在肾脏组织表达分布显著增加,而E-cadherin(6.93±1.51 vs 23.05±2.51)表达分布显著下降;与UUO+NS组相比,UUO+Insl6组α-SMA(11.26±1.05 vs 20.07±2.49)、FN(8.48±0.43vs 14.66±1.2 2.35)和TGF-β1(6.74±0.83 vs 16.09±2.05)在肾脏组织表达分布显著下降,E-cadherin(16.09±2.46 vs 6.93±1.51)则显著增加,半定量分析显示差异有统计学意义(P<0.05)。(4)与Sham组相比,RT-PCR显示UUO+NS组α-SMA(1.78±0.09 vs 0.25±0.07)、FN(1.08±0.13±2.46vs 0.24±0.04)和TGF-β1(2.07±0.16 vs 0.40±0.05)m RNA表达水平显著上升(P<0.05),E-cadherin(0.30±0.06 vs 1.81±0.13)m RNA表达显著下降(P<0.05);与UUO+NS组相比,UUO+Insl6组α-SMA(1.13±0.15 vs1.78±0.09)、FN(0.72±0.04±2.46 vs 1.08±0.13)和TGF-β1(1.08±0.11 vs2.07±0.16)m RNA水平显著下降(P<0.05),E-cadherin(0.67±0.07 vs0.30±0.06)m RNA水平则显著上升(P<0.05)。(5)与Sham组相比,UUO+NS组TGF-β1蛋白(0.62±0.03 vs 0.21±0.03)、磷酸化的Smad2(0.77±0.04 vs 0.33±0.05)和磷酸化的Smad3(0.44±0.04 vs0.21±0.02)蛋白表达显著增加(P<0.05),与UUO+NS组相比,UUO+Insl6组TGF-β1(0.36±0.05 vs 0.62±0.03)蛋白、磷酸化的Smad2(0.50±0.03 vs 0.77±0.04)和磷酸化的Smad3(0.31±0.02 vs0.44±0.04)蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论:Insl6具有抑制肾脏纤维化的作用,该作用可能与抑制TGF-β1/Smad2/3信号通路有关。第二部分:Insl6抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化的作用及机制研究目的:探讨Insl6对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞上皮-间充质细胞转分化(EMT)的影响及机制。方法:不同浓度TGF-β1(0,1,2,5,10ng/ml)刺激人肾小管上皮细胞(HK-2)72小时候后,Western Blotting检测平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)、及E-钙连蛋白(E-cadherin)表达。采用加或不加人Insl6蛋白处理的TGF-β1诱导HK-2作为对象,分为空白对照组,TGF-β1处理组,Insl6处理组以及TGF-β1+Insl6处理组,RT-PCR和Western Blotting检测E-cadherin、α-SMA和纤维连接蛋白(FN)m RNA及蛋白表达,同时Western Blotting检测Smad2和Smad3蛋白及其磷酸化的水平。结果:(1)随TGF-β1浓度增加,HK-2细胞E-cadherin蛋白表达逐渐降低,α-SMA蛋白表达逐渐增高,TGF-β1浓度10ng/ml时(0.32±0.02vs 1.30±0.06)最显著(P<0.05)。(2)与对照组相比,TGF-β1组HK-2细胞α-SMA(2.00±0.12 vs 0.36±0.02)和FN(1.34±0.16 vs 0.69±0.13)m RNA表达显著增加(P<0.05),α-SMA(0.63±0.06 vs 0.26±0.04)和FN(0.63±0.06 vs0.30±0.02)蛋白表达也显著增加,E-cadherin m RNA(0.16±0.08 vs1.14±0.13)及蛋白(0.33±0.05 vs 0.90±0.17)表达显著下降(P<0.05);与TGF-β1组相比,TGF-β1+Insl6组α-SMA(1.08±0.13 vs 2.00±0.12)和FN(0.78±0.23 vs 1.34±0.16)m RNA表达显著下降(P<0.05),α-SMA(0.38±0.03 vs 0.63±0.06)和FN(0.40±0.01 vs 0.63±0.06)蛋白表达也显著下降(P<0.05),E-cadherin m RNA(0.88±0.23 vs 0.16±0.08)及蛋白(0.85±0.15 vs 0.33±0.05)表达显著上升(P<0.05)。(3)与对照组相比,TGF-β1组磷酸化的Smad2(1.38±0.07 vs 0.59±0.06)和磷酸化的Smad3(0.63±0.07 vs 0.30±0.05)蛋白水平显著上升(P<0.05);与TGF-β1组相比,TGF-β1+Insl6组磷酸化的Smad2(0.76±0.05 vs 1.38±0.07)和Smad3(0.36±0.11 vs 0.63±0.07)蛋白水平显著下降(P<0.05)。结论:TGF-β1可诱导HK-2细胞发生转分化,且与浓度相关。Insl6可抑制TGF-β1诱导HK-2细胞发生转分化,其机制可能与抑制Smad2/3通路激活有关。