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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原,在我国猪群中广泛存在,给养殖业造成严重经济损失。当前用于防控PCV2感染的疫苗主要包括灭活疫苗和亚单位疫苗。近年来,PCV2与伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)混合感染十分普遍,造成仔猪严重的呼吸系统疾病以及母猪繁殖障碍,新出现的PRV变异强毒株给临床防控提出新的挑战和难题。本研究以PRV为病毒活载体,将PCV2 Cap蛋白基因插入PRV基因组内,以期构建能够表达高水平PCV2 Cap蛋白的重组PRV病毒,旨在为这两种病毒性疫病的防控提供一种基因工程疫苗。研究表明,PRV胸苷激酶(TK)基因是病毒毒力相关基因,该基因缺失对病毒复制能力没有明显影响,但使其毒力大大降低。我们首选PRV TK基因作为靶点,在缺失该基因的同时替换插入PCV2 Cap基因,构建了一种表达PCV2 Cap蛋白基因的重组PRV TK缺失毒株。本研究构建了2个重组转移载体pMD18T-LR(TK)-EGFP和pMD18T-LR(TK)-Cap,前者包含缺失TK基因的左右同源臂和EGFP表达盒,后者包含缺失TK基因的左右同源臂和Cap蛋白表达盒。将pMD18T-LR(TK)-EGFP和PRV-JF毒株的基因组DNA共转染PK-15细胞,经同源重组方法用EGFP表达盒替换TK基因,经绿色荧光蚀斑筛选和PCR鉴定,筛选获得缺失TK基因的重组病毒rPRV-TK-/EGFP+。以该重组毒株为材料,经同源重组方法用PCV2 Cap表达盒再替换EGFP表达盒,经无绿色荧光蚀斑反式筛选和PCR鉴定,获得表达PCV2 Cap表达盒的重组病毒rPRV-TK-/Cap+。用PCV2 Cap蛋白特异性单克隆抗体进行IPMA方法鉴定PCV2 Cap蛋白的表达,结果检测不到Cap蛋白的表达,证实该重组毒株不能表达Cap蛋白,分析可能与插入的位点或者表达盒有关。为了进一步构建能高效表达PCV2 Cap蛋白的重组PRV,又以rPRV-TK-/Cap+重组病毒为材料,选择PRV gE基因为新的插入靶点。首先构建了2个重组转移载体pMD18T-LR(gE)-EGFP和pMD18T-LR(gE)-Cap(CI),前者包含缺失gE基因的左右同源臂和EGFP表达盒,后者包含缺失gE基因的左右同源臂和Cap蛋白表达盒。将重组转移载体pMD18T-LR(gE)-EGFP与重组病毒rPRV-TK-/Cap+基因组DNA共转染PK-15细胞,经同源重组方法用EGFP表达盒替换gE基因,通过绿色荧光蚀斑筛选和PCR鉴定,获得TK、gE双基因缺失的重组毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/EGFP+。以该重组毒为材料,将重组转移载体pMD18T-LR(gE)-Cap(CI)与其基因组DNA共转染PK-15细胞,经无绿色荧光蚀斑反向筛选和PCR鉴定,获得TK、gE双基因缺失含有两个Cap蛋白表达盒的重组毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CI)。经IPMA和Western blot试验检测Cap蛋白的表达水平,结果显示用Cap蛋白特异性单克隆抗体可以检测到Cap蛋白的表达,表明该重组病毒能有效地表达Cap蛋白。为了进一步增强Cap蛋白的表达量,本研究从改变Cap蛋白表达盒的启动子和优化Cap基因密码子两方面,经同源重组方法构建了携带Cap蛋白复合启动子表达盒的重组病毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CA)和携带Cap蛋白密码子优化表达盒的重组病毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+opti(CA)。经IPMA和Western blot检测结果表明,上述两种重组毒均可以有效地表达Cap蛋白,然而这3种重组毒株rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CI)、rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CA)和rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+opti(CA)Cap表达量的差异并不显著。一步PRV-JF的要弱。用构建的重组毒株接种家兔显示其毒力明显降低,表明对家兔是安全的,具备了作为疫苗研制的可能。UL42蛋白是PRV病毒DNA聚合酶的辅助亚基,对病毒复制是必需的。UL42的体外功能已被证实,有关UL42的单克隆抗体所识别的抗原表位到目前仍未见报道。本实验室制备了6株针对UL42蛋白的单抗(2D5、4E2、2G11、5F8、7C11和8F9),通过Western blot和ELISA方法对这些单抗识别的抗原表位进行了鉴定。结果显示,有两个区域的氨基酸(aa)(39~148 aa和302~384 aa)能与UL42单抗反应。通过合成一系列针对这两个区域的短肽,最终鉴定出了这6株单抗能够识别3个抗原表位,其中表位116SGGVLDALK124位于UL42的氨基端,而354KRPAAPR360和360RMYTPIAK367位于UL42的羧基端。氨基酸序列分析显示,这3个表位在不同的PRV毒株间是高度保守的。此外,用这些单抗建立的间接免疫荧光试验法检测到UL42蛋白在病毒的复制过程中定位于细胞核内;用这些单抗进行的免疫沉淀试验可将UL42蛋白从感染PRV的PK-15细胞中沉淀出来;用这些单抗还建立了一种新的IPMA方法可用于PRV病毒含量测定。因此,这些单抗在UL42蛋白结构和功能研究中提供了非常有用的工具。