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氮肥作为提高粮食作物所必须的营养元素以供给其生长,在提高产量及品质的同时,也因植物不能将氮肥完全吸收,致使土壤盐碱化及水域的富营养化严重。而豆科植物与根瘤菌之间形成的根瘤共生体系使植物可以将空气中的氮转化为植物能够吸收利用的形式,对环境与农业的可持续发展具有重要作用。目前对根瘤共生体系分子机制的研究已取得一定成果。研究发现,宿主植物细胞对根瘤菌侵染早期的反应是根表皮细胞核周围钙离子浓度的震荡(Ca2+spiking)。侵入线的形成与根瘤原基的发育都需要依赖钙/钙调素蛋白激酶(Calcium-and calmodulin-dependent protein kinase,CCaMK)对 Ca2+spiking 信号进行解码,以此转导信号来激活级联事件。研究发现Ca2+的结合只能调节CCaMK自动抑制结构域的释放,与启动根瘤器官的形成有着密切关系;而只有在钙调素(Calmodulin,CaM)存在时,CCaMK才会表现出激酶活性,调控侵入线的形成。因此,本研究通过构建系统发育树鉴定百脉根(Lotus japonicus(Regel)K.Larsen)的钙调素基因。选择LjCaM4为研究对象,探讨其在不同组织中的表达量及它与Ca2+的结合能力。通过设计特异引物对LjCaM4进行3’-RACE克隆;利用荧光定量qPCR分析LjCaM4的表达;构建LjCaM4的原核表达载体进行原核表达;通过Ni Sepharose TM亲和层析柱进行蛋白纯化,对其与Ca2+的结合能力及迁移率变化等活性进行分析。主要实验结果如下:1)通过 HMMPfam、HMMSmat 和 Superfamily 三种方法搜索L.japonicu 全基因组获得具有EF-hand结构域的全部蛋白;利用拟南芥AtCaM1的cDNA序列作为参考序列比对NCBI中L.japonicus的基因组序列,收集E-value>3e-64的序列。通过InterProScan软件对所有序列进行结构域分析,得到只具有EF-hand结构域的序列47个,其中同源性在23%以上的有26个。通过最大似然法和贝叶斯推理构建系统树将这26个基因划分为两类:7个LjCaMs和19个类钙调素(Calmodulin like protein,LjCMLs)。2)利用3’-RACE技术对LjCaM4进行克隆得到一段642 bp的序列,包含了完整的ORF和PolyA结构。生物信息学分析发现:LjCaM4分子式为C741H1168N186O260S9,原子总数为2364,分子量为17.13 kDa,理论pI值为4.03,半衰期为30 h,蛋白不稳定系数为35.46,总平均亲水性为-0.505。LjCaM4二级结构中α-螺旋占65.33%、无规则卷曲占23.33%、延伸链占6%、β-转角占5.33%,以α-螺旋为主。LjCaM4没有跨膜区域,4 个 EF-hand 分别位于 1240、48-76、85-113、121-149,共有 16 个 Ca2+结合位点。3)荧光定量qPCR检测发现LjCaM4在百脉根不同组织中的表达量存在显著的差异,其中根部表达量最高,依次为根>茎>叶>豆荚>花。4)通过BamH I和Xho I酶切位点把LjCaM4接连到原核表达载体pET28-a(+)上,并将该重组质粒pET28-a(+)-LjCaM4转入大肠杆菌Rosetta中,通过抗生素(Kan+Ch1)及PCR筛选获得阳性转化子。以诱导剂IPTG(浓度分别为1 mmol/L、2 mmol/L及3 mmol/L)在37。C时对阳性转化子进行诱导表达,将收集得到的大肠杆菌菌体进行超声波破碎,将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳检测,发现在与理论值大小相符的20.1 kDa处均有一条特异的蛋白条带,表明该蛋白得到了表达。通过超声破碎菌体,将上清用NiSepharoseTM亲和层析柱进行纯化,BCA法测定纯化蛋白的总浓度为 360 μg/mL。5)以EGTA为钙螯合剂、LjCaM1为对照,LjCaM1与LjCaM4分别结合Ca2+后进行电泳迁移率的比较,结果显示用Ca2+与EGTA处理后LjCaM1与LjCaM4蛋白之间电泳迁移率具有差异,LjCaM4是LjCaM1电泳迁移率的2倍。以上研究结果可为进一步探明LjCaM4的生物学功能提供一定的理论依据。