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据国际糖尿病联盟(IDF)最新公布的数据,截止到2019年,我国糖尿病患者约为1.164亿人,已成为全球患病人数最多的国家。2型糖尿病(T2DM)在糖尿病人群中所占比例高达90%,其可诱发心血管疾病、肾病、视网膜病变以及神经病变等并发症,给患者家庭和社会带来沉重的经济负担。T2DM并非终身性慢性疾病,可通过适当的膳食干预得到有效的预防和改善。因此,开发天然、安全、高效的食品功能因子以替代传统药物对T2DM进行膳食干预具有十分重要的现实意义。我国核桃资源丰富,分离自核桃仁蛋白的核桃蛋白酶解物(WHPs,3-10kDa)已被证实具有降血糖活性,但活性肽的结构和在关键调控中的作用机理有待进一步明确。本文主要对核桃活性肽的制备、纯化、结构鉴定及降血糖活性进行了系统研究。主要研究结果如下:(1)在完成WHPs(3-10kDa)Sephadex G25和Sephadex G15葡聚糖凝胶分离纯化的基础上,采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对核桃水解肽进一步分离纯化,得到单一组分F1。利用电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)技术对组分F1进行结构鉴定,共获得432种具有不同氨基酸序列的活性肽。根据文献报道和BIOPEP数据库(http://www.uwm.edu.pl/biochemia)比对,从中筛选出10种具有潜力的活性肽,其氨基酸序列分别为Leu-Pro-Leu-Leu-Arg(LPLLR)、Leu-Val-Arg-Leu(LVRL)、Leu-Arg-Tyr-Leu(LRYL)、Pro-Asp-Leu-Thr-Arg-Ala-Leu-Arg(PDLTRALR)、Pro-Asp-Thr-Leu-Ala-Arg(PDTLAR)、Leu-Asp-Val-Val-Asp-His-Leu(LDVVDHL)、Val-Asp-Leu-Leu-Leu-Arg(VDLLLR)、Leu-Gly-Val-Leu-Leu-Arg(LGVLLR)、Leu-Val-Val-Asp-His-Leu(LVVDHL)、Glu-Ala-Ala-Gly-Val-Leu-Glu-Val-Leu-Arg(EAAGVLEVLR)。应用固相合成技术合成以上10种活性肽,评估降血糖活性和抗氧化活性。(2)初步通过α-葡萄糖苷酶抑制率、α-淀粉酶抑制率以及氧自由基吸收能力(ORAC)3个试验验证活性肽。以上结果表明,LPLLR、LRYL、LVRL和EAAGVLEVLR的活性优于其他活性肽,并用于下一步的细胞验证试验,验证活性肽在胰岛素抵抗(IR)人肝癌细胞(HepG2)模型下的葡萄糖消耗能力和抗氧化能力。IR HepG2细胞模型建立条件:在高糖浓度25mmol/L,胰岛素浓度10-6mol/L的环境下诱导36h。结果表明,LPLLR、LVRL和LRYL均可显著提高IR HepG2细胞的葡萄糖消耗能力及增强谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性,且能有效清除细胞内活性氧(ROS)的含量,然而EAAGVLEVLR则不能显著改善上述作用。(3)探讨LPLLR对IR HepG2细胞葡萄糖代谢的影响及作用机制。结果表明,LPLLR可通过增加GSK-3β在Ser9位点的磷酸化和GS的表达来促进糖原合成,又可通过增加GLUT4的表达和转运提高糖摄取,并通过下调G6Pase、PEPCK、TORC2、CREB和PGC-1α的表达抑制糖异生。机制研究表明,LPLLR可能介导激活IRS-1/PI3K/Akt和AMPK信号通路缓解IR,进而发挥降血糖作用。(4)LPLLR稳定性分析结果表明:LPLLR具有耐高温和耐酸碱的特性,并且通过模拟胃肠道消化后,发现LPLLR仍能保证结构完整性,说明在IR HepG2细胞内是LPLLR发挥的降血糖和抗氧化作用。