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背景自1963年Starzl施行首例人体原位肝移植术以来,肝移植目前已被广泛接受,已成为治疗终末期肝病的唯一有效手段。但供肝离体后的缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)常导致原发性移植肝无功能(primary graft nonfunction,PNF),并被认为是继排异反应之后引起再移植的第二大原因。因此如何能够减轻移植肝脏的缺血再灌注损伤是肝脏外科领域中的热点研究问题之一。1986年Murry等首先提出缺血预处理(ischemic preconditionning, IPC)概念,即数次短暂重复心肌缺血/再灌注,能提高心肌对此后发生较长时间缺血的耐受性,减轻再灌注损伤。近年来学者研究发现组织器官缺血后在再灌注早期给予数次短暂的再灌注/缺血也能保护组织器官,它具有同IPC相似的保护作用,遂提出了缺血后处理(ischemic postconditioning, IPO)的概念。但是缺血再灌注损伤一旦形成,IPC失去了治疗的最佳时间,而IPO是缺血后的措施,在治疗IRI上正好弥补IPC的不足,所以在临床上有更大的应用价值。目前IPO的具体保护机制仍不完全清楚。它发挥作用的可能机制,主要是通过对氧自由基、钙超载、中性粒细胞、细胞因子、细胞凋亡、线粒体等几个方面的作用来实现。肝脏缺血再灌注损伤中肝窦状内皮细胞和肝细胞的死亡方式是以细胞凋亡的方式存在。近来关于线粒体的研究表明,线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用,而缺血再灌注损伤早期主要表现为线粒体结构的改变。线粒体功能障碍已成为肝脏缺血再灌注损伤的一个重要机制,线粒体在IPO抗IRI过程中起关键作用。肝脏再灌注开始的前几分钟是引起再灌注损伤的关键时刻,这个时刻同时也是实施IPO的时间窗,因而IPO作为一种再灌注早期的干预机制对于缺血再灌注损伤肝脏有着重要的保护作用,这一作用可能是通过干预线粒体的结构和功能从而减少肝细胞凋亡来实现的。因此从线粒体角度来研究IPO对缺血再灌注所致肝细胞凋亡保护作用具有重要意义,并且线粒体膜通透性转换孔道与IPO密切相关。本论文通过观察IPO对IRI大鼠肝细胞凋亡的影响以及对肝细胞线粒体形态和功能的作用,进一步探讨其是否通过抑制线粒体途径来减轻缺血再灌注损伤,为后续研究缺血后处理的保护作用机制和寻找抗肝脏缺血再灌注损伤作用靶点提供理论依据。目的用改良二袖套法建立可靠大鼠同种异体原位肝移植模型,探讨机械性缺血后处理方式在减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的作用及其可能机制。为临床防治肝移植缺血再灌注损伤提供一种新的可能的方法。材料与方法1.选用清洁级健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,体重200-250g。在Kamada二袖套法大鼠肝移植模型的基础上进行适当改良,建立改良的大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤动物模型。2.动物分组：将40只健康成年雄性SD大鼠随机分为3组,①假手术组(Sham组)：开腹后仅游离肝周韧带然后关腹；②缺血再灌注组(I/R组)：供肝植入后完全放开门静脉,再灌注；③缺血后处理组(IPO组)：门静脉完全再通前,按照再灌注60s,夹闭60s,循环6次,然后完全放开。3.指标检测：门静脉复流后6h取标本：检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)浓度评价肝功能情况；RT-PCR检测肝脏组织中Bcl-2 mRNA和BaxmRNA的表达；Western Blotting检测肝组织Cyt-c蛋白；流式细胞仪检测肝细胞凋亡坏死情况和线粒体跨膜电位的变化；光镜及电镜下观察肝组织细胞及线粒体形态结构的变化。结果1.I/R组和IPO组的血清转氨酶ALT、AST水平明显高于Sham组(P<0.05)；I/R组的ALI、AST水平明显高于IPO组(P<05)。2. RT-PCR结果显示：与Sham组相比I/R组和IPO组肝脏组织中Bax mRNA的表达明显上调,其中I/R组比IPO组更加明显(P<0.05)。IPO组和I/R组肝脏组织中Bcl-2 mRNA的表达较Sham组相比明显下降,其中I/R组比IPO组下降明显(P<0.05)。3. Western Blotting检测结果显示：I/R组和IPO组Cyt-c蛋白含量显著高于Sham组(P<0.05)；I/R组肝脏组织中Cyt-c蛋白含量显著高于IPO组(P<0.05)。4.流式细胞仪检测显示：I/R组和IPO组的大鼠肝脏组织细胞凋亡坏死率与Sham组相比明显增加(P<0.05)；其中I/R组的大鼠肝脏组织细胞凋亡坏死率明显高于IPO组(P<0.05)。I/R组和IPO组肝细胞线粒体跨膜电位较Sham组明显下降(P<0.05)；其中I/R组较IPO组下降明显(P<0.05)。5.HE染色显示：Sham组肝小叶结构完整,肝细胞及汇管区结构正常。I/R组肝小叶中央静脉和肝血窦淤血明显,肝细胞广泛水肿,不同程度空泡样变性。IPO组肝小叶结构基本完整,肝细胞及汇管区基本正常,仅少数肝细胞轻度水肿。6.电镜结果显示：I/R组超微结构改变较重,肝细胞结构完整性被破坏,线粒体肿胀,部分空泡样变性。IPO组肝脏组织细胞结构完整性尚可,线粒体肿胀较IRI组轻。结论1.改良的大鼠肝移植缺血再灌注损伤模型是一种稳定、可靠、简便的模型,可操作性强。2.缺血后处理对大鼠移植肝冷缺血再灌注损伤具有保护作用,能够有效的减轻移植肝缺血再灌注损伤,减少肝细胞凋亡,改善肝功能。3.线粒体途径是IPO方式减轻大鼠HIRI的途径之一,其作用机制是机械性IPO方式通过增加抑凋亡基因Bcl-2的表达而降低促凋亡基因Bax的表达并提高两者的比值,抑制MPTP的开放维持线粒体跨膜电位(ΔΨm)的稳定(或升高)和保护线粒体的结构功能,减少Cyt-c等凋亡蛋白的释放,从而阻止肝细胞凋亡并最终减轻HIRI。