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目的:拟建立博尔纳病病毒(BDV)核蛋白血清学抗体检测方法,为BDV大规模筛查提供快速、简便、经济、准确的手段,亦为博尔纳病病毒核蛋白作用机制研究提供支持。方法:1、根据BDV P40基因序列设计引物,扩增BDV P40基因后构建重组质粒。鉴定筛选正确后,转化至大肠杆菌中,表达BDV重组核蛋白,亲和层析技术纯化该蛋白后,SDS-PAGE分析其表达量及纯度, Bradford法鉴定蛋白表达量,Western-blot法鉴定重组蛋白免疫原性,质谱法鉴定表达蛋白分子量及成分。2、辣根过氧化物酶(HRP)标记重组BDV核蛋白,为后期行双抗原ELISA检测抗体方法提供酶标抗原。3、将重组BDV核蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔,得到兔抗-BDV核蛋白多克隆抗体。4、重组BDV核蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记的重组BDV核蛋白作为酶标抗原,初步建立了双抗原夹心BDV血清抗体ELISA检测法,并检测其有效性。结果:1、成功构建了可用于BDV核蛋白基因表达的重组质粒。重组质粒经酶切鉴定及核酸序列分析验证正确。2、成功的在大肠杆菌中表达了BDV重组核蛋白。重组蛋白具有较高的纯度和良好的免疫原性。SDS-PAGE分析表明,经过亲和层析后E.coli中表达的重组蛋白纯度可达90%;WB分析表明,重组博尔纳病病毒核蛋白具有良好的免疫原性;质谱鉴定,表明重组博尔纳病病毒核蛋白与天然博尔纳病病毒核蛋白结构一致。3、验证了重组核蛋白与抗体之间具有特异性结合能力,说明重组蛋白可以作为包被抗原使用。ELISA法确定重组BDV核蛋白与单克隆抗体具有随稀释浓度改变的特异性结合能力,但与其它抗体则无此量效关系。4、初步建立了博尔纳病病毒核蛋白抗体双抗原夹心ELISA检测法,测定了最佳抗原包被浓度及最佳酶标抗原浓度等参数。结论:1、重组BDV核蛋白与天然的BDV病毒核蛋白具有一致的免疫原性与结合力,可用于替代天然BDV病毒核蛋白用于ELISA的检测。2、初步建立了双抗原检测血清中博尔纳病病毒抗体ELISA检测方法,确定了部分技术参数。