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目的: 以Rac1蛋白为靶点，利用分子对接软件对先导化合物大黄酸的侧链结构进行修饰并设计合成新型大黄酸衍生物4F（文中简称4F），探索其抗肿瘤活性、诱导乳腺癌细胞非凋亡程序性死亡作用机制。 方法: 1.采用分子对接软件MOE.2008模拟大黄酸及4F与Rac1蛋白的相互作用模式;利用多功能酶标仪检测大黄酸及4F的荧光激发光谱和发射光谱、激光共聚焦显微镜检测大黄酸及4F在细胞中的分布;利用CCK-8法比较大黄酸及4F的抗肿瘤活性、细胞毒性;Western Blot实验在蛋白水平验证4F对Rac1蛋白的调控;荧光素酶报告基因实验在细胞转录水平验证大黄酸及4F对Rac1表达的调控作用。 2.以高表达Rac1的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞及以低表达Rac1的MCF-7细胞系为细胞模型，经不同浓度大黄酸及4F处理细胞相应时间之后，采用CCK-8法检测受试细胞活性，克隆形成、生长曲线检测细胞增殖，Transwell小室及Matrigel胶检测细胞迁移及侵袭能力，流式细胞仪检测细胞周期分布、凋亡率变化，采用HE染色、F-actin染色、溶酶体荧光探针、线粒体荧光探针、DAPI染色观察细胞形态、细胞骨架及细胞器的改变。 3.采用透射电子显微镜观察受试细胞超微结构变化，免疫荧光实验检测LC3在细胞内定位及表达，Western Blot实验检测自噬相关蛋白LC3、p62、Beclin-1，凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-7、caspase-9、Apaf-1、XIAP，内质网应激蛋白Grp78在细胞内的表达情况，运用mRFP-GFP-LC3慢病毒监测受试细胞自噬流强弱，确定4F诱导非凋亡程序性死亡的机制。 结果: 1.大黄酸及4F与RAC1蛋白对接的ASE分值分别为-15.4729Kcal/mol、-25.3146Kcal/mo，分值越低，与RAC1蛋白结合能力越强;4F具有自发荧光，最大发射波长为525nm;4F容易被细胞摄取，主要分布在细胞质及细胞核周围;4F对不同肿瘤细胞的抑制作用呈浓度及时间依赖性，其抑制卵巢癌、肝癌、鼻咽癌、骨肉瘤及乳腺癌细胞增殖的IC50值均低于15tmo/L，优于先导化合物大黄酸;4F对正常乳腺细胞MCF-10A的细胞毒性最小，远小于阿霉素。Western Blot结果显示MDA-MB-231、MCF-7、MCF-10A细胞均表达Rac1蛋白，其中MDA-MB-231表达水平最高;与空白细胞相比，4F能抑制MDA-MB-231、MCF-7细胞中Rac1蛋白表达;荧光素酶报告基因实验显示成功构建含Rac1-promoter-LUC2稳转细胞系，4F可以在转录水平靶向抑制该细胞的Rac1活性。 2.4F作用乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞48h后IC50值分别为(12.80±0.83)μmol/L、(7.54士1.25)μmol/L;克隆形成实验结果显示4F和大黄酸均能减少细胞集落形成数量;细胞生长曲线结果显示4F处理组的MDA-MB-231及MCF-7细胞倍增时间分别为119.72h及79.4h，远低于control组;MDA-MB-231细胞迁移及侵袭能力强于MCF-7，4F能抑制MDA-MB-231细胞迁移及侵袭;大黄酸、4F对细胞周期分布及凋亡率无明显影响;4F处理的乳腺癌细胞体积减小、骨架重排、溶酶体数量增多体积增大、细胞质出现空泡等非凋亡死亡的形态学变化。 3.电镜结果显示4F处理MDA-MB-231、MCF-7细胞后细胞结构仍完整，细胞核碎裂、溶解，细胞内质网、线粒体肿胀;在MDA-MB-231细胞内可观察到自噬小体及自噬溶酶体，而在MCF-7细胞中观察到大量细胞质空泡。免疫荧光及Western Blot结果显示，对于MDA-MB-231细胞，与空白对照组相比，4F可增加LC3及LC3Ⅱ的表达水平，并升高Beclin-1表达水平、降低p62表达，mRFP-GFP-LC3监测自噬流结果显示4F处理6h后，观察到黄色和游离红色荧光点，与自噬激活剂雷帕霉素相似，提示早期自噬体形成。而加入自噬抑制剂3-MA可阻碍黄色和游离红色斑点的形成。4F处理细胞12h后，绿色和黄色荧光斑点明显减少，说明自噬体逐渐发展为自噬溶酶体。与MDA-MB-231细胞不同，4F可增加MCF-7细胞LC3及LC3Ⅱ的表达水平4F，但同时也增加Grp78、p62表达。提示4F诱导MCF-7细胞的死亡与自噬通路无关。4F对两种细胞的凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-7、caspase-9、XIAP、Apaf-1表达水平均无明显影响。 结论: 1.靶向Rac1蛋白设计的4F是一种易被细胞摄取，毒性小，抗肿瘤活性优于先导化合物大黄酸的新型蒽醌化合物;转录水平和蛋白水平均抑制Rac1表达，4F可能是Rac1蛋白小分子抑制剂。 2.4F可能诱导乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7细胞发生非凋亡程序性死亡。 3.4F诱导乳腺癌细胞非凋亡性程序性死亡，其中，诱导MDA-MB-231细胞死亡途径可能是自噬性死亡，而诱导MCF-7细胞死亡可能与内质网应激性副凋亡有关。